赖姝毓 王鼎南 宋 健 张宜明 庞林江 柴婷婷

(1浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300；2浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310023)

孔雀石绿(malachite green，MG)是一种三苯甲烷类染料，具有高毒素、高残留、致畸、致癌、致突变等副作用[1]，因其对水霉病具有显著的治疗效果且廉价易得被养殖者们应用于水产养殖中。 MG 进入鱼体后经过代谢会转变为对人体具有更大危害的隐性孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)[2-3]。 上世纪90年代开始，美国、日本、英国等国家就禁止MG 应用于食用水产动物的养殖，我国也于2002年将其列入禁止检出清单[4]。 截至目前，MG 滥用的情况已经得到好转，但仍有养殖者在水产养殖过程中非法使用MG。 因此，实现MG 快速检测以及现场监测已成为水产技术部门急需解决的关键问题。

针对MG 的检测目前大多采用液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[5-6]、液质联用法( high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLC-MS)[7-8]等。 近年来还开发出了一些快速检测新方法，如基于生物免疫反应的酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[9]、电化学发光结合分子印记技术[10]以及表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced raman scattering，SERS)[11]。 尽管仪器分析方法具有灵敏度及精度较高等优势[12-13]，但也存在成本较高、耗时较长、检测结果不够直观等问题；而直读显色具有便捷与低成本的优势，因此，开发新型的直读显色方案仍是食品安全快速检测不断追求的目标。

薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)是一种经典的显色检测方法，兼具纸色谱与柱色谱的优势，至今仍被诸多研究者应用于实际样品的分析[14]。 虽然通过TLC 与其他仪器进行偶联，如光密度仪、拉曼光谱仪[15-16]，可以更加有效地实现快速灵敏检测，但对于现场快速分析而言，直读显色分析仍然具有一定优势。 传统方法采用展开后喷涂显色剂[17-18]或直接在展开剂中加入显色剂[19]以实现对待测物的检测，其检测过程存在以下问题:1)背景信号过高；2)喷雾法依赖个人操作其显色结果难以重现；3)精确定量能力不足等。 本研究在TLC 基础上结合纳米自显色技术，提出了一种可以实现自显色的TLC 条带快速灵敏检测MG 方案。 依托于TLC 板本身的优异分离性能及优化后的展开条件，采用单向展开方式将目标待测物(LMG)与实际样品中的其他干扰物质完全分离。 进一步基于溶胶-凝胶法将传统显色剂构建为纳米显色材料，承载了纳米材料所独有的优异性能，以打印方式将其固定在LMG 对应比移值(retention factor value，Rf)处，形成一个自显色区，显色后的斑点更加清晰，提高了信噪比，高度重现的显色结果保证其能够实现半定量直读显色分析。 本研究针对养殖水体中MG 残留构建的TLC 直读自显色方案，在食品安全快速分析领域具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三氯甲烷、碘酸钾、七水合硫酸锌等，分析纯，均购自上海国药集团化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，美国TEDIA 公司；盐酸羟胺，分析纯，杭州源叶生物科技有限公司；碘化钾，分析纯，西陇化工股份有限公司；对甲苯磺酸(纯度＞99%)，上海麦克林生化科技有限公司；甲苯，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；钛酸四丁酯(纯度＞99%)，北京百灵威科技有限公司；MG/LMG 标准品(纯度＞99%)，美国aladdin 公司；D5、D6孔雀石绿同位素(纯度＞99%)，德国Dr.Ehrensorfer 公司。 0.1 mol·L-1钛酸四丁酯前驱体溶液，自制。

样品提取液:取3 g 盐酸羟胺和0.24 g 对甲苯磺酸溶于100 mL 水。

MG/LMG 标准储备液:分别称取0.1 g MG/LMG标准品用乙腈溶解后定容至10 mL，此为10 mg·mL-1高浓度标准储备溶液。 进一步用乙腈稀释浓度为0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000、 2.000、 4.000、8.000 μg·mL-1的LMG/MG 梯度工作溶液。

1.2 仪器与设备

25 μL 微量进样针，宁波镇海玻璃仪器有限公司；SPDY-1A 平面色谱点样仪，南京科迈理特科学仪器有限公司；硅胶G60 薄层层析板，德国默克公司；DLSB-2005 循环水式多用真空泵，杭州大卫科教仪器有限公司；FLUKO FA25 均质器，德国费鲁克公司；XW-80A 涡旋混合器，上海精科实业有限公司；2-16KL 高速冷冻离心机，德国西格玛公司；NK200 可视化氮吹仪，杭州米欧仪器有限公司；马尔文粒度仪3000，英国马尔文仪器有限公司。

1.3 纳米显色剂制备与表征

纳米显色剂制备:将普通定量滤纸裁成圆形，尺寸与抽滤装置上的砂芯漏斗相匹配。 倒入适量前驱体溶液，静置，使滤膜表面充分吸收前驱体溶液，以无水乙醇充分洗涤后加入5%碘酸钾溶液，待其水解反应1 min 后再以无水乙醇冲洗将滤纸抽滤干燥。 在此过程中，碘酸钾分子以吸附包裹和交联固定的方式构筑在纳米二氧化钛结构中。 重复上述过程最终形成负载碘酸钾@二氧化钛的滤纸。 取下滤纸置于烧杯中，加适量乙醇均质即可得到分散均匀的碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料。

电镜表征:精确移取10 μL 碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料乙醇分散液(0.381 g·mL-1)于扫描电镜观察碘酸钾@二氧化钛的粒子形貌。 取1 mL 纳米复合材料分散液，室温挥发干燥后经溴化钾压片等过程供红外光谱表征。 另取适量纳米复合材料分散液稀释后，用马尔文粒度仪测量其粒径。

1.4 基于TLC 法的样品提取

取20 mL 养殖水用滤纸净化去除沙石等杂质，转移至分液漏斗中，加入2 mL 样品提取液及20 mL 二氯甲烷，振揺5 min，静置分层后收集二氯甲烷层于梨形瓶中。 重复提取1 次，合并二氯甲烷层，30℃旋转蒸发至近干。 用乙腈复溶后，加入0.3 mL 0.2 mol·L-1硼氢化钠[2]将样品中的MG 全量转化为LMG，氮吹浓缩至0.2 mL，待上样。

1.5 纳米直读显色条带的制备

取活化完成的层析板(2 cm×4.5 cm)，在距底边0.5 cm 与4.0 cm 处标记，分别为上样位置与展开剂前沿到达时的终止位置，展距为3.5 cm。 打印装置吸取约10 μL 碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料乙酸分散液(0.381 g·mL-1)打印在LMG 对应Rf值区域。

1.6 TLC 直读显色方法

在TLC 板上样线均匀标注上样位置，用平面色谱点样仪以点状上样方式打印20 μL MG 标准溶液及已处理的水样，控制上样点直径范围在0.2 cm 以内。 待展开剂溶液(氯仿∶甲醇，4 ∶5)前沿展开至TLC 板上的终止线时取出，快速浸入KI 显色支持液中，加热至显色。 显色路线如图1 所示。

1.7 显色条件的优化

1.7.1 碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料打印量的优化 取活化完成的层析板，做3 组对照，分别打印5、10、15 μL 均质碘酸钾@二氧化钛钠米复合材料乙醇分散液(0.381 g·mL-1)，干燥后待用。 每块板均上样32、16 ng·spot-1LMG 2 个点，对比显色效果选择碘酸钾@二氧化钛复合材料最佳打印量。

1.7.2 显色支持液浓度的优化 取3 块成品显色板，分别上样32、16 ng·spot-1LMG 2 个点，对比1%、5%、10%质量浓度KI 显色支持液的显色效果，确定最佳浓度。

图1 直读显色路线示意图Fig.1 Diagram of color rendering principle

1.7.3 显色支持液pH 值的优化 给予一定的酸性环境，可使本研究所报道的直读显色体系达到增色效果，因此本研究用硫酸调节KI 显色支持液pH 值为1、2、3、4，对比显色效果。

1.7.4 显色增色液浓度的优化 试验过程中发现硫酸锌水溶液可有效消除背景干扰，对比测试了CK(仅加热，不另外浸溶液)、水溶液硫酸根离子溶液及锌离子溶液，确定适当浓度的锌离子可消除TLC 板显色后残留的黄色碘化物，选取3 块直读显色板均上样32、16 ng·spot-1LMG 2 个点，显色完全后浸入浓度为0.1、0.5、1.0 mol·L-1锌离子溶液中，对比3 组显色效果。

1.8 方法验证

1.8.1 线性范围和检出限 LMG 标准品溶液(0.06～8.0 μg·mL-1)上样20 μL 于直读显色TLC 板上，显色后用Image J 软件对显色后条带进行数据分析，探究条带色度对应峰面积与LMG 浓度(ng·spot-1)之间的相关性，并对校正数据进行线性回归分析，根据标准曲线计算本方法的肉眼最低检出限。

1.8.2 精密度、准确度和回收率 选取空白养殖水样品加入MG 标准品使其浓度分别为20、40 和80 μg·L-1。 基于Image J 软件在同一天用该方法对每种添加量的混合物进行6 次分析，计算回收率与精密度。

1.9 HPLC-MS 方法

取20 mL 水加入30 μL 1.0 μg·mL-1D5、D6 孔雀石绿同位素内标溶液，用二氯甲烷与乙腈进行提取，具体步骤与仪器条件参考DB 12/T 866-2019[20]。

2 结果与分析

2.1 碘酸钾＠二氧化钛纳米复合材料的表征结果

通过溶胶-凝胶过程，可以形成不同粒径的氧化物纳米颗粒[21-23]。 本研究经过3 层组装，获得了均匀分散的碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料，其扫描电镜形貌以及分散状态如图2-A 所示。 用马尔文粒度仪检测其粒径主要分布在758 nm 左右。 由图2-B 可知，碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料与碘酸钾单质在700 ～820 cm-1光谱区存在相似的吸收峰，此为IO-3 基团所造成的[24]，证实碘酸钾被有效地组装在纳米二氧化钛上，形成了复合材料。

图2 碘酸钾＠二氧化钛纳米复合材料微观结构扫描电镜图(A)与红外表征(B)Fig.2 SEM images of potassium iodate＠nano-titanium dioxide nanocomposites(A)infrared absorption spectrum(B) of potassium iodate nanomaterials

2.2 检测参数与条件优化

2.2.1 展开剂及Rf值的确定 本研究所用展开剂为氯仿∶甲醇=4 ∶5，展开后LMG 斑点集中，不会出现拖尾现象。 其中，LMGRf值为0.914，因此纳米显色材料选择打印在该Rf处。

2.2.2 碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料打印量的优化 由图3-A 可知，当碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料打印量为10 μL 时，条带颜色最明显，推测是因为5 μL 碘酸钾@二氧化钛形成的碘单质较少，氧化能力不足因而显色较浅；而打印量为15 μL 时二氧化钛过量对显色造成了覆盖。 综上，碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料的最佳打印量为10 μL。

2.2.3 显色支持液浓度的优化 图3-B 为不同浓度KI 显色支持液显色对比。 在1% KI 浓度条件下，KI与碘酸钾@二氧化钛形成的碘单质有限，缺乏氧化能力造成显色斑点颜色较浅。 对比5%、10%组显色条带，10%组显色未明显加深，因而KI 显色支持液最佳浓度为5%。

2.2.4 显色支持液pH 值的优化 KI 在酸性条件下会与碘酸钾、孔雀石绿形成蓝绿色离子络合物[25]，据此进一步对KI 显色支持液在不同pH 值条件下的显色效果进行比较(图3-C)，结果表明KI 显色支持液pH 值为3 时可达到最佳显色效果。

2.2.5 增色液浓度的优化 铝基薄层板上打印碘酸钾@二氧化钛纳米材料，与KI 显色支持液反应后会在TLC 板上残留黄色碘化物，仅靠加热无法使其完全升华因而会产生颜色干扰。 试验过程中发现浸硫酸锌水溶液可有效消除背景颜色，并达到一定的增色效果。

在这一过程中，由于大部分锌离子络合物是无色的[26]，因此推测是锌离子与过量的碘离子-元素碘形成了无色络合物从而消除了背景干扰色。 而已被氧化显色的MG 本身是一种络合物，锌离子不会与其反应覆盖显色信号。 通过试验进一步佐证了该推测(图3-D)，0.5 mol·L-1硫酸根溶液不能消除背景，仅锌离子溶液消除了背景干扰。 经过优化，锌离子溶液浓度优选为0.5 mol·L-1。

2.3 孔雀石绿直读显色方法的线性范围、半定量分析及检出限

图4-A 为LMG 标准显色板(1.25～160 ng·spot-1)，用Image J 软件对显色后的条带进行灰度分析，将颜色深浅度转化为峰高信号(图4-C)，采集每个斑点对应的峰面积数据(n=3)建立MG 标准曲线(图4-D)。 由图4-D 可知，峰面积与MG 浓度之间存在明确的线性关系，相关系数达到了0.99。

图3 显色条件优化合图Fig.3 Optimized combination of color rendering conditions.

图4 孔雀石绿直读显色检测合图Fig.4 Malachite green direct reading color development detection map

选取当地的养殖水样品按照前文所述方法进行前处理提取，另添加一定量的MG 标记为阳性加标样品，基于样品提取液中杂质较多，故采用10 μL 上样量进行显色分析(图4-B)。 对照标准曲线图，用肉眼判断得出阳性样品MG 总量浓度约为30 μg·L-1，根据Image J 软件分析得出该样品所对应的峰面积，从标准曲线上读出阳性样品中MG 总量为30.48 μg·L-1，与肉眼判断结果相符。 该法线性范围为2.5 ～160 μg·L-1，肉眼最低识别检出限为1.6 μg·L-1。

2.4 回收率和精密度

根据加标后的检测结果，计算得出本方法回收率为69.5%～78.38%，RSD 在12%左右，作为半定量方法，本方法的精确度在可接受范围内。

2.5 HPLC-MS 验证

将直读显色法检测得出的养殖水阴性样品与阳性样品按照DB 12/T 866-2019[20]的液质方法进行分析，阴性样品未检出，阳性样品中MG 含量为34.65 μg·L-1，显色分析结果在可行性范围内。

3 讨论

在本研究中，样品中的MG 首先被全量还原为LMG，这与岑剑伟等[27]报道的HPLC 法及钱蓓蕾等[28]开发的免疫试剂盒法类似。 转化后的LMG 溶于有机相而易被浓缩，为下一步TLC 显色分析做好了准备。 条带上固定的碘酸钾@二氧化钛会与KI 加热形成游离态Ⅰ2[29-31]，该游离态碘先将LMG 氧化为MG，在酸性条件下再与Ⅰ3-特异性结合形成MG(Ⅰ3)2蓝绿色络合物[25，32](显色原理如图5 所示)。 宋友林等[24]研究指出锌离子与靛蓝分子的络合物在可见光区没有吸收峰，据此推测在本研究中锌离子与残留的碘化物形成了无色络合物。 而显色后的MG 本身已是络合物，锌离子不会与其反应，由此消除了颜色干扰，增加了信噪比。 上述显色机理，为今后研究其他三苯甲烷类染料(结晶紫等)显色分析提供了理论基础。

图5 显色原理示意图Fig.5 Diagram of color rendering principle

一般来说，TLC 分析中显色完成后的显色斑点颜色深浅度与样品浓度之间存在相关关系，Image J 软件的分析结果也验证了这一点。 本研究构筑的碘酸钾@二氧化钛粒径远小于TLC 板上的固体硅胶颗粒，当待测组分转移至显色区时，易被硅胶固相表面负载的纳米显色材料基于毛细管力吸附至表面，放大显色信号。此外，优化后的直读显色分析方法是一个可控的体系，表现为良好的重现性及精密度。 基于以上几点，本研究得以突破常规TLC 法中肉眼难以实现半定量分析的局限性，同时HPLC-MS 法也验证了肉眼判定结果的可靠性。

目前，MG 的检测手段以HPLC 为代表的仪器检测方法为主。 Sun 等[33]报道的HPLC 法中，MG 的检出限为0.2 μg·L-1，高于本研究方法的灵敏度，但没有出现明显差异。 从成本角度来说，本方法依赖2 cm×4.5 cm 的TLC 条带及3～4 mL 展开剂即可显色分析，成本较低。 此外，利用多通道条带展开装置，可同时进行大批量样品的检测，且样品提取后完成展开及显色仅需15 min，这是仪器方法难以实现的一点。 因此，本研究所报道的方法在水产安全快速分析领域具有广泛的应用前景。 针对养殖水体样品，通过本研究的显色策略可实现MG 的快速定性及半定量分析。 但面对更复杂的基质，如鱼、虾类样品，其体内富含油脂、蛋白质，还需进一步优化展开体系及前处理方法，以期在复杂基质中捕获目标待测物。

4 结论

本研究基于溶胶-凝胶法构筑了碘酸钾@二氧化钛纳米复合材料，结合碘化钾显色支持液，首次提出了一种基于TLC 图像分析法的MG 快速检测与半定量方法。 采用Image J 软件对显色后的条带进行分析，证实显色斑点色度与待测物浓度之间存在明确的线性关系(R2=0.99)，即可用肉眼以色度为指标进行半定量判别。 同时，HPLC-MS 法证实本方法具有良好的特异性及可靠性。 本方法线性范围为2.5 ～160 μg·L-1，检出限达1.6 μg·L-1，RSD 在12%左右，精确度较好。 本研究构筑的直读显色条带具有简单快捷、结果直观及成本较低的优势，且操作步骤简单，即使缺乏相关基础的人员也极易入手，在水产品及养殖水体中MG 超标检测领域具有较大的应用潜力。 此外，基于本研究提出的显色机理，有望在TLC 平台上实现其他三苯甲烷类染料(结晶紫等)的直读显色分析，构建一个多组分显色分析体系。