田宇，徐晨露，黄丹妮，冯钰东，陈佳峰，刘晨阳，金永堂,*

1. 环境表观遗传实验室，杭州 310058 2. 浙江大学医学部，杭州 310058

随着城市化进程的加快，全球空气质量已不容乐观，根据世界卫生组织的数据，全球91%的人口每天呼吸着受污染的空气，而尾气排放已成为空气污染的主要原因[1]。交通尾气成分非常复杂，主要有害物质包括细颗粒物、氮氧化物和二氧化硫等。这些污染物可以通过呼吸系统进入血液循环，透过血脑屏障进入大脑，造成炎症反应和氧化应激损伤，引起中枢神经系统异常改变[2]。

自闭症是一种神经发育障碍性疾病，主要表现为沟通困难、社交障碍和重复刻板行为。美国国家疾控中心数据显示，自闭症患病率从2012年的1.46%增长到2016年的2.47%[3]，但病因未明，且治疗困难。Volk等[4-6]对美国加利福尼亚州的病例进行研究发现，母亲怀孕期间和后代出生后第一年暴露于与交通有关的空气污染、NO2、PM2.5和PM10与自闭症有关。Kerin等[7]的调查显示，孕早期NO2暴露剂量与儿童认知、适应能力评分呈负相关。Pagalan等[8]的研究指出，儿童自闭症与母亲孕期NO暴露有关(优势比(OR)=1.07，95%置信区间(CI)=1.01～1.13)而与NO2和PM2.5无关。总的来说，在交通空气污染与自闭症关系的研究中，虽然有一些阴性结论[9]，但大部分研究结果都证明了二者的联系[6,10-11]，也提示仍需要进一步实验性研究来证明交通空气污染与自闭症的因果关联。有研究利用动物实验，采用柴油机颗粒物急性吸入的方式模拟交通空气污染物暴露，研究结果显示，动物出现了自闭症样改变，但模拟浓度较高，无法真实反映人群的尾气暴露状况[12]。

自闭症病因机制未明，目前认为，除了遗传因素外，受环境影响的组蛋白甲基化等表观遗传改变可能在调控大脑发育过程中发挥了关键作用。H3K4甲基化修饰作为一种染色质标志，广泛参与许多生物学过程，包括异染色质的形成、X染色体失活和转录调控等，与基因表达激活有关[13]。H3K4甲基化异常会改变其与RNA聚合酶的结合状态，影响DNA转录，进而引起大脑发育的改变，与神经发育和神经系统疾病有关[14]。有研究表明，一些与H3K4去甲基化相关的特异性酶发生基因突变与自闭症有关[15-16]。此外，部分自闭症患者脑组织中存在H3K4甲基化上调及分布范围扩大，伴相应基因转录产物的表达异常，而这些基因通常与神经元连接、社会行为和认知功能有关[17-18]。值得注意的是，人类大脑皮质中的H3K4甲基化修饰从产前发育期间到幼儿期甚至青春期都是动态调节的[19]，可能会在与外界环境相互作用的过程中发生一些自闭症相关的改变。

因此，本研究采用模拟人体生活环境的交通道路实地暴露方法，将Wistar孕鼠在整个孕期或窝鼠整个哺乳期分别置于校园对照区域、普通路段及城市主干道十字路口进行交通空气污染物暴露，然后对其子代进行生长发育测量及行为学分析，通过更真实的人群生活环境来探索出生前后交通空气污染暴露对大鼠自闭症样行为的影响，并分析出生前后暴露于交通空气污染物与脑组织H3K4甲基化调控的关系，为深入认识自闭症的危险因素、病因机制和预防措施提供思路。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 主要仪器材料

纤维滤膜(江苏盐城思锐仪器)，中等流量悬浮颗粒物采样器(浙江恒达仪器，ZC-Q0101)，PM2.5-PM5-PM10-TSP切割器(浙江恒达仪器)，Any-maze动物行为分析系统(美国Stoelting公司)，总组蛋白提取试剂盒(美国Epigentek公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)，总组蛋白H3K4甲基化定量检测试剂盒(美国Epigentek公司)。

1.2 实验动物

SPF级健康成年Wistar大鼠(上海斯莱克)，雌雄各36只，体重250～300 g。

1.3 实验方法

1.3.1 动物处理及分组

将Wistar大鼠雌雄1∶1合笼过夜，次日清晨检查到阴栓的雌鼠认为交配成功，记为胚胎期第0天(E0)，产仔当天记为出生后第0天(P0)。根据暴露时间(胚胎期E、出生后P)和暴露浓度(低L、中M、高H)将受孕雌鼠随机分为6组，每组6只，分别为EL、EM、EH、PL、PM和PH。

1.3.2 暴露地点与暴露装置

根据交通车流量及城市道路等级，选择浙江大学紫金港校区内某树林作为低污染暴露组，选择紫荆花北路(四车道)某点作为中污染暴露组，选择城市主干道文一西路和古墩路交叉口作为高污染暴露组。暴露时，E组大鼠每2～3只一笼，妊娠晚期分笼；P组大鼠每窝一笼。各自放置于校园内、紫荆花北路路边及十字路口路边0.5～1.0 m高处进行暴露。暴露从清晨7:30开始到傍晚19:30结束，持续20 d(E1～E20、P1～P20)。出生后21 d(P21 d)断奶，每组仔鼠中取雌雄各10只进行后续研究。

1.3.3 现场污染物监测

暴露期间，每天记录杭州市气象监测数据，包括天气、气压、温湿度、风力风向和空气质量指数(Air Quality Index, AQI)，并从中选取7 d进行高峰期交通空气污染物浓度的现场检测，检测指标包括NOx和PM2.5，每次监测持续1 h，各暴露点同时检测。

1.3.4 生长发育测量

P25 d，对仔鼠称重、测量身长后施安乐死，迅速解剖取脑组织称重，将生物样本编号并放于-80 ℃冰箱备用。

1.3.5 社交行为测试

P21 d断奶后，从每组中选取雌雄各10只，送到浙江大学动物中心适应性饲养1～2 d，P22～P23 d进行三箱社交行为测试。三箱社交实验是检测社会交往能力的经典实验，也是评价自闭症动物模型时最常用到的行为测试[13]，如图1。实验包括3个阶段：第一阶段让被测鼠在3个箱室内自由活动5 min以适应环境；第二阶段随机向其中一个笼子内放入陌生鼠1(Stranger 1)，让被测鼠自由活动10 min，被测鼠对陌生鼠1或空笼(Empty)的嗅探时间(Sniffing times)及嗅探频次(Sniffing frequencies)代表它的社交意向：社交能力正常的仔鼠倾向于接触新朋友而非空笼；第三阶段向笼内放入另一只陌生鼠2(Stranger 2)代表新朋友，陌生鼠1代表老朋友，通过记录10 min内被测鼠与二者的接触可评估其社交记忆能力及社交新颖性：通常情况下，大鼠具有探索及喜新厌旧的本性，更愿意接触新鲜事物。测试结束后带回实验室，饲养于洁净环境中。

1.3.6 组蛋白H3K4甲基化检测

取仔鼠大脑皮质组织样本0.2 g进行组蛋白提取，用BCA法测定蛋白浓度，之后根据总组蛋白H3K4甲基化试剂盒提供的方法定量检测总组蛋白H3K4甲基化水平，记为H3K4me(ng·μg-1prot)=OD(样品-空白)×1000/(蛋白量×斜率)。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 22.0统计分析。定量资料用均数±标准差表示。2组间比较采样独立样本t检验或配对t检验，3组间比较采用单因素方差分析，多重比较用LSD法(方差齐)或盖姆斯法(方差不齐)。P≤0.05为差异有统计学意义。

图1 三箱实验示意图Fig. 1 Sketch map of three chambers test

2 结果(Results)

2.1 暴露现场空气污染状况

研究中选取的高浓度暴露点位于古墩路和文一西路交叉口，这2条道路均为杭州市区主干道，通常情况下每小时车流量为2 000～2 500次，高峰期可达3 500次以上，且经常出现交通拥堵及车辆怠速。中浓度暴露点位于紫金花北路，是城市辅助道路，通常情况下每小时车流量为800～1 000次，高峰期为1 500次以上。校园内清洁区域内树木植被较多，通常情况下无车辆通行。图2是杭州城市信息一点通网站公布的某日高峰期暴露地点周边的车流量情况。

低、中和高浓度暴露点NOx(以NO2计)的1 h平均浓度均未超过国家卫生标准(GB3095—2012)，分别为(52.76±22.46)、(110.30±59.32)和(138.89±65.89) μg·m-3；方差分析有统计学意义(P<0.05)，两两比较显示低、高浓度间存在差异(P<0.01)。暴露期间杭州市区NO2月平均浓度为44.5 μg·m-3。

PM2.5的1 h平均浓度在低、中和高浓度暴露点分别为(71.67±38.47)、(91.43±45.38)和(101.67±53.37) μg·m-3；组间差异无统计学显著性(P>0.05)。暴露期间杭州市区PM2.5月平均浓度为45 μg·m-3。

2.2 子代一般体征和发育指标检测

各组子鼠均未出现明显异常，皮毛顺滑，活动及饮食正常，双眼无异常分泌物。出生后25 d，测量子鼠身长体重并施安乐死，剥离完整大脑并称重计算脏器系数，生长发育指标见表1。胚胎期暴露于不同浓度的交通空气污染对出生后体重、身长及大脑脏器系数均有影响(P<0.001)，对身体质量指数(Body Mass Index, BMI)无影响(P>0.05)；出生后暴露于不同浓度交通空气污染对生长发育的影响均无统计学差异(P>0.05)。在中、低浓度水平下，出生后暴露组的体重、身长及BMI均低于胚胎期暴露组(P<0.001)，大脑脏器系数则高于胚胎期暴露组(P<0.001)；高浓度下虽然也出现这种趋势，但差异并无统计学意义(P>0.05)。

2.3 社交能力检测

交通空气污染对各组仔鼠社交能力的影响如图3所示。EL组接触Stranger 1的频次及时间均显著大于空笼(P<0.01)，EM组接触Stranger 1的频次更高(P<0.05)而时间无差异(P>0.05)，EH组接触Stranger 1和空笼的频次及时间均无统计学差异(P>0.05)。方差分析显示，胚胎期不同浓度组间对Stranger 1的嗅探时间及频次均存在差异(P<0.01)，其中EH组的嗅探时间及频次最低。PL、PM和PH各组接触Stranger 1的频次和时间均大于空笼(P<0.05)，但出生后不同浓度组间对Stranger 1和空笼的嗅探时间及频次均无差异(P>0.05)。

图2 某日高峰期暴露地点周边的车流量情况Fig. 2 Traffic flow around exposure site in a daily peak period

在低、中浓度下，暴露时期不同对子代接触Stranger 1和空笼的时间及频次均无影响(P>0.05)。在高浓度下，胚胎期暴露组接触Stranger 1的时间更短，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 子代一般发育指标Table 1 General developmental indicators of offspring

注：1为保留2位小数后分析方便，本文中显示的是大脑脏器系数乘以100后的数值；2BMI为体重指数，为保留2位小数后分析方便，本文中显示的是BMI×10的数值；与低浓度比较，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；与中浓度比较，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；下同。

Note:1In order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 100 times the coefficient of brain organs;2BMI is body mass index, in order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 10×BMI; * compared with low concentration, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; compared with medium concentration, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001; the same below.

图3 交通空气污染对仔鼠社交能力的影响注：EL、EM和EH分别表示胚胎期低浓度、胚胎期中浓度、胚胎期高浓度暴露，PL、PM和PH分别表示出生后低浓度、出生后中浓度、出生后高浓度暴露；下同。Fig. 3 Effects of traffic-related air pollution on social ability of offspringNote: EL, EM and EH stand for low, medium and high concentrations of exposure in the embryo, respectively, while PL, PM and PH stand for low, medium and high concentrations of exposure after birth, respectively; the same below.

2.4 社交记忆及新颖性检测

交通空气污染对各组仔鼠社交记忆及新颖性的影响如图4所示。EL、EM组接触Stranger 2的时间及频次均高于Stranger 1(P<0.05)，EH组对二者的嗅探无差异(P>0.05)。方差分析显示，不同浓度组对Stranger 1或Stranger 2的嗅探时间及频次均无差异。PL组对Stranger 1和Stranger 2的嗅探存在差异(P<0.05)，PM、PH组对二者的嗅探均无差异(P>0.05)。不同浓度间对Stranger 1的嗅探时间及频次随浓度增加而递增，对Stranger 2的嗅探递减，但均无统计学差异(P>0.05)。相同浓度下，未见暴露时期对接触Stranger 1或Stranger 2的频次及时间的影响(P>0.05)。

2.5 组蛋白H3K4甲基化水平

采用酶联免疫吸附法测定了各暴露组仔鼠脑皮质区的总组蛋白H3K4甲基化水平(图5)。结果显示，E组在各浓度下的H3K4甲基化未见统计学差异(P>0.05)，P组H3K4甲基化则出现浓度依赖性下调，但并无统计学意义(P>0.05)。在相同浓度下，P组H3K4甲基化显著高于E组，差异有统计学意义(L,P<0.01; M,P<0.001; H,P<0.05)。

2.6 组蛋白H3K4甲基化水平与污染物相关性分析

分析了各组子代脑皮质区组蛋白H3K4甲基化与PM2.5、NOx浓度的相关性(表2)，均未发现统计学关联(P>0.05)。

3 讨论(Discussion)

本实验进行期间，对杭州市区环境空气质量及天气状况进行了记录，并对暴露现场高峰期交通空气污染物PM2.5、NOx浓度进行了抽样，发现3个暴露点的污染物含量虽未超过国家标准，但呈现逐级递增的趋势，且均高于杭州市区平均值，最高浓度可达101.67 μg·m-3。主干道十字路口的NOx浓度显著高于校园对照点(P<0.01)，最高浓度达138.89 μg·m-3，提示该区域交通尾气污染严重。

图4 交通空气污染对仔鼠社交记忆及新颖性的影响Fig. 4 Effects of traffic-related air pollution on social memory and novelty of offspring

表2 组蛋白H3K4甲基化与污染物浓度的相关性Table 2 The correlation between histone H3K4 methylation and pollutant concentration

注：r表示相关系数，P表示显著性水平。

Note:rmeans the correlation coefficient,Pmeans the significance level.

图5 组蛋白H3K4甲基化水平Fig. 5 The level of histone H3K4 methylation

本研究中，虽然各组仔鼠在第一阶段社交能力测试中，接触同伴的时间均大于空笼，但胚胎期高浓度暴露组对二者的接触没有统计学差异，且仔鼠对同伴的接触呈随着浓度增加而减弱的趋势；出生后暴露各组虽然对二者的选择性接触均有统计学差异，但对空笼的接触呈随浓度增加而增加的趋势。这说明，生长发育阶段接触高浓度的交通空气污染，尤其是胚胎发育期，会影响子代的社交能力。在第三阶段社交记忆和社交新颖性的测试中，胚胎期暴露组接触新朋友的时间均大于旧朋友，提示社交记忆良好，但高污染组对新、旧朋友的接触无统计学差异，提示其社交新颖性受影响；出生后各组随着暴露浓度增高，仔鼠接触新朋友的时间递减，接触旧朋友的时间递增，高浓度组接触旧朋友的时间甚至超过新朋友，说明其社交记忆和社交新颖性受损。此前，Chang等[20]发现，小鼠宫内和早期生命发育过程中暴露于柴油废气污染(PM2.5约300 μg·m-3、6 h·d-1、5 d·week-1，等于时间加权浓度53 μg·m-3)会出现自闭症样行为缺陷，如交往和社会偏好测试中的社交能力降低，T-迷宫和大理石掩埋测试中的重复行为增加等。Yokota等[21]将孕鼠于妊娠期暴露于柴油废气环境中(90 μg·m-3、8 h·d-1)，发现后代雄性的攻击性增强。Church等[22]将围产期孕鼠暴露于PM2.5环境中(135.8 μg·m-3，全天)，发现幼仔社交能力下降，重复刻板行为增加。Thirtamara等[12]通过孕鼠及子代妊娠期柴油机颗粒物暴露(1 000 μg·m-3、4 h·d-1、5 d·week-1)，发现孕鼠产仔数、体重和健康状态未受到影响；子代虽未出现明显的社交障碍和沟通异常，但自我修饰、饲养和刻板行为增加，与孤独症患者的重复性/强迫行为类似。Li等[23]于雄鼠出生后8～22 d经鼻内滴注PM2.5(2或20 mg·kg-1，每天一次)，发现2组大鼠均表现出典型的孤独症行为特征，包括沟通障碍、社会交往不良和回避新奇等。综合以上发现，再结合本次研究结果，可以推测城市交通主干道的汽车尾气排放水平已经可以对生长发育阶段的幼鼠产生不良影响，使其产生自闭症样行为。

细颗粒物粒径小，可以通过呼吸系统入肺并沉积在肺泡，已被证实与心血管系统疾病、呼吸道疾病及癌症有关。2016年全球PM2.5死因构成比达7.6%，死亡人口达420万[1]。此外，PM2.5还可以随着血液循环通过血脑屏障入脑[24]，或通过胎盘屏障进入胎儿体内[25]，造成DNA损伤或表观遗传异常[26-27]，引起氧化应激与胶质细胞激活等神经炎症[28]，甚至造成幼鼠神经发育改变[29]。NOx是指有氮、氧2种物质组成的化合物，作为空气污染指标的NOx主要包括NO和NO2，而NO在光照等条件下最终变成NO2，除了造成酸雨及臭氧层破坏，还与呼吸道疾病及自闭症有关[30-32]。毒理[29,33-34]和病理研究[35-36]提示自闭症的发病或与交通空气污染物引起神经系统免疫应激及神经炎症等毒性作用有关。这些交通空气污染物引起的氧化应激和炎症损伤会增加遗传物质的不稳定性，可能通过与基因产生交互作用[5,37-39]以及表观遗传修饰的途径影响蛋白质表达，进而诱导自闭症[26,39]。

为了初步探讨交通空气污染物引起仔鼠出现自闭症样异常社交行为的潜在表观遗传机制，本研究检测了各组仔鼠脑皮质区组蛋白H3K4甲基化的水平。结果显示，在不同暴露浓度下，H3K4甲基化水平并未出现显著差异。而Cantone等[40]发现，长期职业性接触富含重金属(镍、砷和铁)的颗粒物会引起工人血清H3K4甲基化水平上调。本研究中未发现H3K4甲基化水平与交通空气污染物的关联，可能是因为当地人群实际生活条件下的污染物浓度梯度尚不足以引起大鼠脑组织H3K4甲基化出现统计学上显著的线性变化，也许还因为H3K4在体内不同组织区域内甲基化水平不一致有关。并且组蛋白修饰往往存在交叉对话，或与其他非组蛋白因素共同作用形成级联修饰，使基因转录调节更加复杂多变，未来的研究可以将更多表观遗传效应纳入研究中。此外，与胚胎期接触交通空气污染物相比，出生后暴露的仔鼠脑组织中H3K4甲基化水平更高，说明不同暴露时期交通空气污染物对脑组织组蛋白H3K4甲基化的影响是有差异的。大脑各个功能区发育的窗口期出现及持续的时间不一样，那么相应基因表达及修饰发生的时间也不同。之前研究表明[19]，大脑高级皮质区的发育与皮质转录组的广泛变化有关，而H3K4甲基化作为转录调节的分子标志，其甲基化的快速增加或减少主要发生在妊娠晚期到出生后第一年，之后逐渐变缓，发育窗口期的外界环境刺激可能更容易影响基因的转录与翻译。

本研究创新地模拟了人群交通空气污染物自然吸入环境，构造的动物模型更接近于人体暴露条件，可以最大限度地还原真实环境。利用经典的社交评价模型——三箱试验，可以根据社交沟通、社交记忆及社交新颖性来评估动物行为，证明本研究中交通污染路口暴露的动物确实出现了自闭症样行为，与此前几项交通污染所致自闭症动物模型结论一致，对自闭症危险因素的研究有一定的参考意义。与此同时，本研究首次比较了不同暴露时期对脑组织H3K4甲基化水平的影响，为今后进一步探讨自闭症的表观遗传机制提供了线索。