陈怡文 张腊红 洪理泉 陈菊萍 唐磊明 陈兆军

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致，是以呼吸系统感染为主的慢性传染病。世界卫生组织对于结核病最新报道显示目前全球约有1/3人感染过MTB，2015年全球新发病例1 040多万，约140万人死于结核病，我国结核患者数量居全球第三位[1]。目前传统的结核检测方法如标本直接涂片抗酸染色镜检、分离培养鉴定等均无法满足快速诊断的要求，采用BACTECTMMGITTM960快速液体培养系统对涂片阳性痰液标本进行检测也需要7～10d才能完成[2]，检测周期长，不能满足临床快速诊断结核病及其防治的需求。分子检测手段能够提高临床肺结核的诊断率。临床目前常用GeneXpert MTB是全自动一体化荧光定量PCR仪专用的MTB检测试剂盒，检测灵敏度和特异度高于现有检测方法[3]，也是目前WHO推荐使用的分子检测方法。近年来，恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing，SAT）作为新一代核酸扩增检测技术，其灵敏度远高于其它核酸检测技术，已广泛用于病原体检测领域[4-5]，特别在涂片阴性痰液标本中有较高的阳性率，可以降低肺结核临床误诊率。本研究采用SAT、GeneXpert MTB和快速液体培养系统对肺结核和其他呼吸系统疾病患者的同一份痰液样本进行MTB检测，比较3种方法学的差异，评估SAT在肺结核快速诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源 选取2016年1月至10月在杭州师范大学附属医院结核科就诊的可疑初治肺结核患者108例，男76例，女32例，年龄35～65岁，平均44岁。并选取同期呼吸科非肺结核呼吸道疾病患者15例作为对照组，男10例，女5例，年龄24～65岁，平均44岁。最终108例可疑肺结核患者中，确诊为肺结核患者102例，非MTB感染者6例，诊断标准参考2010年世界卫生组织发布的“结核诊断与治疗指南”[7]。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 BACTECTMMGITTM960 System全自动分枝杆菌检测系统（美国BD公司），GeneXpert扩增检测仪（美国Cepheid公司），分枝杆菌超声破碎仪、恒温混匀仪（上海仁度生物科技有限公司），ABI7500型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司），离心机（美国Thermo Fisher公司），抗酸染色液（珠海贝索生物技术有限公司），SAT试剂盒（上海仁度生物科技有限公司），GeneXpert MTB检测试剂盒（美国Cepheid公司）。

1.3 标本采集及前处理 采集患者清晨痰液，参照《结核病诊断实验室检验规程》的方法[6]，于采集2h内将痰液标本直接进行抗酸染色镜检，再进行前处理后分别进行SAT、GeneXpert MTB和快速液体培养。前处理过程：挑取约5ml痰液，加入2倍的2%NALC-NaOH前处理液，强力漩涡振荡20s；室温静置15～20min；加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8） 至约 50ml，盖紧盖子；3 000g 离心15min，弃上清液；添加 1～3ml PBS（pH 6.8），混匀备用。

1.4 痰直接抗酸染色镜检 挑取标本有干酪样、脓样或可疑部分涂片，抗酸染色后镜检报告结果。

1.5 SAT检测 将前处理后的痰液进行如下操作：（1）RNA提取：取前处理后的痰液1ml于样品处理管中，13 000g离心5min，弃上清液，加入50μl TB稀释液，充分振荡混匀，即制成待测样本；将待测样本和50μl制备好的阳性及阴性对照放入分枝杆菌破碎仪内，功率为300W的超声处理15min后，13 000g离心5min，上清液即为提取的RNA。（2）扩增：将2μl RNA提取物加入30μl扩增检测液的微量反应管中，置于恒温混匀仪上60℃ 10min，42℃ 5min后向反应管中加入10μl已 42℃预热的酶液，立即盖上管盖振荡15s混匀。（3）检测：将微量反应管快速置于ABI 7500荧光定量PCR仪内，程序设置（选取FAM通道；42℃ 1min，40个循环；每分钟采1次荧光，共40次；反应体系42μl），立即运行扩增程序。（4）结果判断：样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（Ct）≤35的样本为阳性，35＜Ct＜40需复查，结果Ct＜40为阳性，Ct为40或无数值为阴性。

1.6 BACTECTMMGITTM960快速液体培养 取前处理好的痰标本0.5ml接种至MGIT培养管中，放入BACTECTMMGITTM960 system进行培养；培养阳性标本送至杭州疾病控制中心进行菌种鉴定。

1.7 GeneXpert MTB检测 取处理好痰液1ml加入收集管中，加入相当于2倍痰液体积的处理液，旋紧管口，涡旋震荡15～30s，室温培养15min。打开检测盒，取2ml处理后的样本由加样孔缓慢加入检测盒内，然后将检测盒放置到检测模块，仪器开始自动检测，反应结束后，在检测系统窗口下直接观察结果。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。以临床诊断为对照，分别计算SAT、GeneXpert MTB法和BACTECTMMGITTM960 System检测MTB的阳性率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，不同检测方法结果的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

108例疑似肺结核患者痰样本经检测，SAT、GeneXpert MTB法和快速液体培养检测MTB的阳性率分别为 62.0%（67/108）、64.8%（70/108）和 50.0%（54/108）。经χ2检验，快速液体培养法的阳性率分别与SAT和GeneXpert MTB 法比较，差异均有统计学意义（χ2=4.4、7.5，均 P＜0.05）；SAT 法的阳性率与 GeneXpert MTB 法比较，差异无统计学意义（χ2=3.2，P ＞0.05）。

以临床诊断为标准，SAT、GeneXpert MTB法和快速液体培养对MTB检测的灵敏度分别为65.7%（67/102）、68.6%（70/102）和 47.1%（48/102）；特异度分别为 100%（21/21）、100%（21/21）和 71.4%（15/21）；阳性预测值分别为 100%（67/67）、100%（70/70）和 88.9%（48/54）；阴性预测值分别为 37.5%（21/56）、39.6%（21/53）和 21.7%（15/69）。经χ2检验，快速液体培养法的灵敏度分别与SAT和GeneXpert MTB法比较，差异均有统计学意义（χ2=12.0、18.38，均 P＜0.05）；SAT 法的灵敏度与 GeneXpert MTB 法比较，差异无统计学意义（χ2=3.2，P＞ 0.05）。

涂片阳性样本中，SAT、GeneXpert MTB法和快速液体培养的灵敏度分别为 89.1%（49/55）、89.1%（49/55）和83.6%（46/55），3者灵敏度差异无统计学意义。涂片阴性标本中SAT、GeneXpert MTB法和快速液体培养的灵敏度分别为 38.3%（19/47）、44.7%（21/47）和 4.3%（2/47），经χ2检验，快速液体培养法的灵敏度分别与SAT和GeneXpert MTB法比较，差异均有统计学意义（χ2=16.3、21.8，均 P＜0.05）；SAT 法的灵敏度与 GeneXpert MTB 法比较，差异无统计学意义（χ2=0.39，P ＞0.05）。见表1。

3 讨论

MTB的感染已经成为严重的公共卫生问题。传统的MTB检测方法是抗酸染色及金标准细菌培养加鉴定[8-9]，然而这些方法灵敏度低且需要菌量大，检测周期长，这可能使得结核病患者无法快速诊断而错过最佳治疗时间，如何快速检测出MTB，以供临床早期诊断，一直是结核病研究的重要课题。

目前GeneXpert MTB作为WHO推荐使用的分子检测MTB的方法在临床开始使用，其是基于检测靶核酸为DNA的全自动一体化荧光定量PCR，能在2h内从患者新鲜痰液中直接检出是否含有MTB，检测灵敏度和特异度均很高。但目前在中国GeneXpert MTB检测结核及其利福平耐药的费用较高，且临床收费暂未进入患者医保，因此难于广泛应用于临床。

本研究选取了同样具有高灵敏度和特异度的SAT法对疑似肺结核患者痰液进行检测，结果显示SAT和GeneXpert MTB法对疑似肺结核患者痰标本检测的阳性率、灵敏度和特异度均明显高于BACTECTMMGITTM960快速液体培养法，结果与Cui等[10]研究得出的SAT灵敏度和特异度均优于BACTECTMMGITTM960快速液体培养法的结论相符。SAT与GeneXpert MTB法在涂阴的样本中的检出率也明显高于BACTECTMMGITTM960快速液体培养法，降低了临床对肺结核的误诊率。

表1 SAT、GeneXpert和MGIT 960在临床诊断中的方法学比较

SAT法的原理是通过特异性的MTB核糖体RNA扩增引物及优化探针技术，使用M-MLV反转录酶及极高转录活性的T7 RNA多聚酶同时实现核酸恒温扩增和实时荧光检测。此技术检测周期明显缩短，仅需4h即可完成检测，并且能特异性检测MTB，相比BACTECTMMGITTM960快速液体培养法检测时间进一步缩短，且弥补了培养法无法鉴别结核与非MTB的缺陷。本实验样本中临床诊断为非MTB感染者的痰液有6例，均为BACTECTMMGITTM960培养法检测阳性，而SAT检测为阴性，进一步证实了SAT法能特异性检测MTB。应用于临床可以提示医生对于痰培养阳性而SAT法为阴性结果的患者是否可能考虑为非MTB感染[11]。

另外SAT与GeneXpert MTB相比，GeneXpert MTB检测核酸类型为DNA，由于操作不当易引发实验室内交叉污染，且无法区别活菌与死菌[12-13]。而SAT检测核酸类型为RNA，只在活菌中存在，在环境中极易降解，可作为活动性结核诊断及药物疗效监测的方法，并且能减少实验室污染和假阳性率[14]。当然SAT法也有一定的缺点，本次实验结果中确诊为肺结核患者的样本中有4例涂阳培阳样本经SAT检测结果为阴性，可能的原因是此样本中存在RNA酶抑制剂、MTB量少或者检测悬液分布不均等原因[14]。但是SAT法总体假阴性率比较BACTECTMMGITTM960液体培养法已经明显减低。

综上所述，SAT与世界卫生组织推荐使用的分子诊断技术GeneXpert MTB同样都拥有较高的灵敏度、特异度和阳性率，甚至有优于它的特点；应用SAT技术仅需4h即可检测MTB活菌，提高了临床上肺结核快速诊断的准确率及灵敏度，对肺结核快速诊断有重要的价值，值得进一步临床推广和应用。