杨忠学 张云涛 张宇 乔鲁卉 侯玉东

256600,滨州医学院附属医院口腔修复科

富血小板纤维蛋白(PRF)制取[1]自自体血，无毒性、无免疫原性，富含高浓度的生长因子(PDGF、TGF、IL-4等)能够有效促进成骨细胞的增殖分化[2]。葛根素作为一种植物雌激素(异黄酮类衍生物)，近年来研究发现葛根素能够抑制骨吸收防止骨质疏松[3]和影响成骨细胞的增殖和分化[4]，在多名学者的研究[4-6]中发现单纯葛根素对成骨细胞作用时，最佳浓度区间基本趋于10-8～10-6mol/L。但是其对骨结合的影响机制尚有争议。本实验通过观察葛根素在PRF环境培养下对成骨细胞生物学性能的影响，探讨葛根素与PRF可能的协同作用，为临床骨增量手术提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 PRF的制备

采志愿者自体血，按文献[7]方法制备PRF并以α-MEM 培养基浸泡保存。

1.2 CCK8比色法检测细胞增殖

常规培养MC3T3-E1，重悬后以 3×104个/ml 接种于预先铺展PRF的96 孔板，1、4、7 d 加入CCK-8混合液，测定A值。

1.3 碱性磷酸酶(ALP)活性检测

将细胞钙化诱导后，按ALP说明测定1、4、7 d A值。

1.4 RT-qPCR 检测细胞Runx2 mRNA表达

将细胞成骨诱导。7 d后提取总RNA并逆转录 cDNA。选择20 μl 体系进行PCR扩增(引物序列见表1)，随后实时定量PCR测定相关基因。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.5 罗丹明-鬼笔环肽染色

制作细胞爬片，钙化诱导培育24 h。激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架与PRF纤维束形态。

1.6 钙化结节茜素红染色

细胞钙化诱导，培养21 d，待无定形物质形成后取出培养板，茜素红染色，镜下观察拍照。

2 结 果

2.1 不同浓度葛根素对PRF环境细胞增殖的情况

CCK-8比色显示：实验组干预能有效提高细胞增殖活动(图1)。……