姜自红

(滁州职业技术学院 食品与环境工程学院， 安徽 滁州 239000)

0 引言

野菊花和菊花(茶用菊品种)均为菊科菊属多年生草本植物，黄酮类化合物、绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为菊花有效成分[1-4]. 现代研究表明，菊花中的这些成分具有抗氧化、抗癌和治疗心血管病的功能[5-9]. 我国菊属植物种质资源丰富，菊花品种多，野菊种类多[10]. 目前国内已有大量文献报道菊花或野菊中总黄酮含量和绿原酸等有机酸类的提取方法和含量[11-15]，但没有将茶用菊花和野菊的这些成分的含量进行综合比较. 本研究比较了茶用菊花和野菊不同植物花序有效成分含量差异，为菊花品种改良和野菊资源的开发利用提供了参考.

1 原料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

试验材料：5种茶用菊，即大白菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Dabaiju’)、亳菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Bozhou’)、滁菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Chuju’)、黄山贡菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Gongju’)、金丝皇菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Jinsihuangju’)；5种野菊，即萨摩野菊(D.ornatum)、野路菊(D.japonense)、乙立寒菊(D.indicumvar.maruyamanum)、阴岐油菊(D.okiense)、紫花野菊(D.zawadskii(Herb.) Tzvel). 本试验所用材料均取自南京农业大学琐石村菊花实验基地，为基地种质资源圃对应种(品种).

主要试剂：亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等(分析纯)购自南京化学试剂有限公司，甲醇、乙腈(色谱纯)购自天津科密欧化学试剂有限公司，卢丁对照品购自中国药品生物制品检定所，标样样品为上海源叶生物科技有限公司HPLC提供.

主要仪器：LC-1260高效液相色谱(安捷伦)、Cytation3细胞成像多功能检测仪(BioTek)、VGT-2013QTD型号超声波水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)、Scientz-48组织研磨器(宁波新芝生物科技有限公司).

1.2 材料处理方法

于2017年秋季选取开放程度达到70%左右的菊花，确保花朵大小、质量相近. 用清水冲洗，晾干后置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，取适量干花样品，剪碎后统一置于5 mL离心管中并加入小钢珠2粒，使用液氮冷冻后立即使用Scientz-48组织研磨器粉碎20 s，至材料变为细腻的粉末.

1.3 总黄酮的含量测定方法

总黄酮的含量采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定[16].

1.3.1 供试品溶液的制备

取干花粉0.1 g共3份，加70%的乙醇9 mL为溶剂. 于60 ℃超声恒温水浴锅中浸提30 min，以4 000 r/min离心10 min后取上清液，重复提取2次，合并后定容至25 mL，为供试溶液.

1.3.2 对照品溶液的制备

取芦丁对照品于80 ℃烘箱中烘至质量恒定，取5.5 mg的样品以70%乙醇溶液为溶剂，待完全溶解后定容至10 mL，此为对照品溶液.

1.3.3 线性关系

分别精确吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL的对照品溶液至6支不同试管中，按照亚硝酸钠-硝酸铝法[16]，反应后用70%乙醇溶液补足至10 mL. 待溶液显色后以芦丁空白为对照，置于酶标仪中于510 nm 波长处进行比色测定其吸光度，并求出回归方程.

1.3.4 样品含量的测定

分别精确吸取供试品溶液1.0 mL，置于10 mL离心管中，按照亚硝酸钠-硝酸铝法[16]，反应后用70%乙醇溶液补足至10 mL. 显色后于波长510 nm进行测定，用酶标仪测出各样品的OD值，利用回归方程和公式计算出各个样品的总黄酮质量分数.

样品总黄酮质量分数(mg/g)=(C×V2×V0)/(V1×M).

式中：C为质量浓度，M为样品初始质量，V0为供试液的体积，V2为最终稀释的体积，V1为1 mL.

1.4 绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定方法

参考2015年版《中华人民共和国药典》对菊花中的绿原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的测定方法，选用高效液相色谱法(UPLC)进行测定[17].

1.4.1 供试品溶液的制备

取3份干花粉末各0.25 g，加入70%的甲醇9 mL为溶剂，于60 ℃超声水浴锅中恒温浸提30 min，以4 000 r/min离心10 min取上清液. 重复提取2次，合并上清液定容至25 mL. 摇匀并静置后使用微孔滤膜(0.22 μm，有机相)过滤，备用.

1.4.2 对照液的制备

取绿原酸样品360 μg、木犀草苷样品270 μg及3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸样品650 μg，加入70%的甲醇溶解并定容至10 mL. 取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准品混合液，加70%甲醇定容至10 mL，于4 ℃冰箱中保存.

表1 流动相梯度洗脱条件

1.4.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以质量分数为0.1%的乙酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱：柱温为30 ℃，流速为0.4 mL/min，检测波长348 mn，样品进样量为5 μL. 理论板数按3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰计算应不低于8 000.

1.4.4 线性关系

取各浓度的对照溶液，置于进样瓶中，进样量为5 μL，按照1.4.3的色谱条件进行测定.以对照品进样浓度(X)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标进行线性回归.

1.4.5 样品含量的测定

取适量供试液样品，进样量为5 μL，按照1.4.3的色谱条件进行测定.

样品质量分数(%)=(C×V0)/M.

式中：C为质量浓度，M为样品初始质量，V0为最终稀释的体积.

1.5 数据分析

用SPSS 20.0进行数据统计分析，用Duncan的新复极差法检测差异显著性.

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量

表2 10种菊属植物总黄酮质量分数

注：样品间做差异显著性分析，表中数值后不同大、小写字母分别表示处理间差异达0.01和0.05显著水平(Duncan新复极差法).

以芦丁质量浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到

y=0.009 7x+0.016 7，R2= 0.999，n=3.

测得10种菊属植物花序总黄酮质量分数见表2，10种菊属植物的总黄酮质量分数在8.3～29.7 mg/g之间，多数样品总黄酮质量分数在10～20 mg/g之间，但差异不显著. 野菊品种中紫花野菊、野路菊的总黄酮质量分数分别为29.7 mg/g和24.6 mg/g，显著高于多个茶用菊品种. 10种菊属植物的总黄酮含量顺序为：紫花野菊>野路菊>大白菊>黄山贡菊>萨摩野菊>阴岐油菊>滁菊>金丝皇菊>亳菊>乙立寒菊.

2.2 绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量

对照品(A)与样品(B)的HPLC图谱见图1.绿原酸回归方程为y=789.48x-0.208，R2=0.999 6，n=3，绿原酸浓度在3.6～72 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；木犀草苷回归方程为y=1 865.9x-0.592 6，R2=0.999 6，n=3，木犀草苷浓度在6.5～130 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸回归方程为y=642.99x-0.536 1，R2=0.999 6，n=3，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸浓度在2.7～54 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系.

123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5A.对照品B.样品

1.绿原酸； 2.木犀草苷； 3. 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸

图1 对照品与样品的HPLC图谱

测得10种菊属植物绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸质量分数结果见表3. 结果显示：多个样品中可检测出3个活性成分，但阴岐油菊材料未检测出绿原酸含量，可能是该品种绿原酸含量较低.

表3 10种菊属植物绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸质量分数

注：样品间做差异显著性分析，表中数值后不同大、小写字母分别表示处理间差异达0.01和0.05显著水平(Duncan新复极差法).

10种菊属植物的绿原酸质量分数在0.34%～1.93%之间，除阴岐油菊外，均高于《中华人民共和国药典》规定的质量分数不少于0.2%的要求. 不同菊属植物的绿原酸含量差异显著，其中乙立寒菊的绿原酸质量分数达1.93%，显著高于其他材料，不同野菊种间绿原酸含量差异显著. 茶用菊品种中黄山贡菊的绿原酸质量分数最高，为0.65%，各茶用菊品种绿原酸含量存在差异. 各材料绿原酸含量顺序为乙立寒菊>紫花野菊>野路菊>黄山贡菊>金丝皇菊>大白菊>亳菊>滁菊>萨摩野菊>阴岐油菊.

10种菊属植物的木犀草苷质量分数在0.53%～2.33%之间，均远高于《中华人民共和国药典》规定的质量分数不少于0.08%的要求. 各材料的木犀草苷含量差异显著，其中野路菊质量分数最高达1.33%；茶用菊品种中滁菊质量分数最高，为1.29%. 各材料的木犀草苷含量顺序为野路菊>滁菊>大白菊>黄山贡菊>萨摩野菊>紫花野菊>亳菊>金丝皇菊>阴岐油菊>乙立寒菊.

10种菊属植物的3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸质量分数在0.38%～3.50%之间，其中7种材料的3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量高于《中华人民共和国药典》规定的质量分数0.7%的最低要求. 不同菊属植物间3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量差异显著，其中乙立寒菊的质量分数最高，为3.5%；茶用菊品种中黄山贡菊质量分数最高，为2.29%. 各材料的3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量顺序为乙立寒菊>黄山贡菊>野路菊>紫花野菊>金丝皇菊>滁菊>>萨摩野菊>大白菊>亳菊>阴岐油菊.

图2 10种菊属植物花序有效成分含量聚类分析

2.3 聚类分析

根据4个有效成分的分析数据，运用SPSS 20.0软件对10种菊属植物进行了Q型聚类分析，详见图2. 根据图2结果可知，菊属植物在阈值为25时分为两大类，即野路菊、紫花野菊为一类，其他菊属植物为一类. 当阈值为5时，菊属植物被分为4小类，即亳菊、金丝皇菊、滁菊、萨摩野菊、阴岐油菊为一类，大白菊与黄山贡菊为一类，乙立寒菊为一类，野路菊与紫花野菊为一类. 结果表明，多种菊属植物的花序有效成分具有一定的相似性.

3 讨论

除阴岐油菊材料未检测到绿原酸外，各试验样品中基本可检测到4种活性物质的存在，且测得的绿原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量均高于2015 年版《中华人民共和国药典》规定的相关含量标准. 所测菊属植物材料的活性物质含量差异显著，其中紫花野菊总黄酮含量最高，乙立寒菊的绿原酸含量最高，野路菊的木犀草苷含量最高，乙立寒菊的3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量最高，说明多种野菊材料的一个或多个活性物质含量高于茶用菊品种.

部分野菊与多种茶用菊花序有效成分含量上具有相似性，有入药潜质，或可作为茶用菊的远缘杂交材料，用于丰富现有茶用菊种质资源，选育具有较高活性成分含量或优良性状的菊花品种.