程亚伟，邱晓堂，丁一，吴小翠，张永杰

海南省中医院治未病中心，海口 570203

在我国，糖尿病(diabetes mellitus，DM)是仅次于高血压的第二大慢性疾病[1-2]，其慢性并发症对患者的生活质量造成极大影响。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是DM的常见并发症，是终末期肾病的主要病因[3]。DN患者存在复杂的糖脂代谢紊乱、氧化应激反应、血液高凝状态、肾脏毛细血管功能受损等问题[4]。中医学认为，DN归属于“消渴”“消瘅”“水肿”“关格”等范畴，“从脾论治”是其主要的治疗观点之一[5]。滋脾通络方主要成分为黄芪、当归、赤芍、川牛膝等，有滋阴补气、活血通络的作用。据海南省中医院治未病中心10余年的临床应用反馈，该方可改善DN患者的血糖水平及肾功能[6]。本研究使用滋脾通络方治疗DN模型大鼠，探究其治疗DN的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验仪器与试剂 H2050R-1型高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；AL204型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；卓越金采血糖仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]；SA-6000型全自动血流变测试仪(北京赛科希德科技发展有限公司)；BK-400型全自动生化分析仪(BIOBASE博科控股集团有限公司)。链脲佐菌素(streptozocin，STZ)、羧甲基纤维素钠、枸橼酸、枸橼酸三钠(杭州天动立化学品有限公司)，其余试剂均为分析纯。

1.2实验药品 根据动物体表面积比率换算，每千克大鼠体重对应药量为：黄芪4.50 g，山药1.80 g，当归1.80 g，赤芍1.35 g，怀牛膝1.80 g，生大黄0.45 g，鬼箭羽1.35 g，水蛭0.90 g，三七粉0.27 g。药材由海南省中医院制剂室制备并提供，制备方法：每次制备10份量，以水作溶剂煎煮提取两次，第1次用水量为总药材剂量的10倍，第2次为5倍，每次提取2.5 h，合并两次提取药液，滤布过滤后真空袋包装冷冻储存。

1.3实验动物及分组 成年SPF级雄性SD大鼠30只，体重80～100 g，购自浙江省医学科学院，生产许可证号：SCXK(浙)20140001。采用随机数字表法将大鼠随机分为3组：糖尿病肾病模型组(DN组)、滋脾通络方干预组(DZ组)及正常对照组(O组)，每组10只。实验过程符合国家及单位有关实验动物的管理和使用规定。

1.4实验方法 大鼠适应性饲养7 d后，O组给予正常饲料饲养。DN组及DZ组大鼠给予高糖高脂饲料(热量为4.43 kcal/g)喂养4周，然后按35 mg/kg腹腔注射1%STZ枸橼酸缓冲液，夜间禁食喂养3 d后，每隔24 h自尾静脉采血测空腹血糖值，连续3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L，视为造模成功。O组大鼠腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。造模成功1周后，DZ组按体重给予对应药物灌胃，DN组及O组给予羧甲基纤维素钠灌胃，连续给药8周。

1.5指标检测 造模成功后，观察大鼠一般情况。在第1、2、4、6、8周，每周一称量大鼠体重，测尾静脉血糖。第8周周六将大鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液，检测尿蛋白含量。第9周周一麻醉处死大鼠，腹主动脉取血，检测血清生化指标和血液流变学指标。取左侧肾脏，生理盐水洗净吸干后，称量肾脏质量，计算肾脏指数。肾脏指数=左侧肾脏重量/体重。取右侧肾脏处理后制备HE染色切片，光学显微镜下观察肾脏组织病理改变情况。

1.6指标分析 通过大鼠一般情况、肾功能(肾脏指数及24 h尿蛋白)、肾脏病理、体重及血糖、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平对大鼠DN病情进行综合分析。通过血清生化指标中的总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，血液流变学指标中的全血高、中、低切变率(300 /s、115 /s、1 /s)下的全血黏度(WBV)、血浆黏度(MPAs)、全血还原黏度(WBRV)对大鼠的脂代谢、血液流变学和瘀血阻络证候进行分析。

1.7统计学处理 采用SPSS 19.0软件行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况比较 O组大鼠一般情况正常。DN组及DZ组大鼠造模成功后体重降低，多饮多尿，反应呆板，毛色晦暗，肢体末端颜色发暗。经药物干预后DZ组大鼠症状有所缓解。

2.2各组大鼠肾功能比较 与O组相比，DN组大鼠的肾脏指数及24 h尿蛋白水平升高；与DN组相比，DZ组大鼠的肾脏指数及24 h尿蛋白水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3各组大鼠肾脏组织病理学表现 O组大鼠肾脏组织正常；DN组大鼠肾小球结构紊乱，细胞增生明显；DZ组大鼠肾小球结构有所恢复，细胞增生好转，肾小管水肿减轻(图1)。

表1 滋脾通络方对各组大鼠肾功能的影响(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

表1 滋脾通络方对各组大鼠肾功能的影响(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

与O组比较，(1)P<0.05；与DN组比较，(2)P<0.05。

图1 各组大鼠光镜下肾脏组织病理变化(HE ×400)Fig.1 Light microscopic pathology of renal in three groups of rats (HE ×400)

2.4各组大鼠体重及血糖水平比较 造模成功后，DN组及DZ组大鼠体重低于O组，差异有统计学意义(P<0.01)。DN组大鼠体重自造模成功后逐渐下降，而DZ组大鼠在滋脾通络方治疗后体重逐渐上升，第4、6、8周时，DZ组体重明显高于DN组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。造模成功后，DN组及DZ组大鼠血糖水平明显高于O组，差异有统计学意义(P<0.01)。采用滋脾通络方治疗后，DZ组血糖水平逐渐下降，第4、6、8周时，DZ组血糖水平明显低于DN组，差异有统计学意义(P<0.01，表3)。

2.5各组大鼠的血清生化指标比较 DN组及DZ组的Scr、BUN、TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于O组，DZ组的BUN、TC、TG、LDL-C均低于DN组，差异有统计学意义(P<0.05)。DZ组及DN组的Scr及HDL-C差异无统计学意义(P>0.05，表4)。

2.6各组大鼠的血液流变学指标比较 DN组及DZ组大鼠的WBV、MPAs及WBRV均明显高于O组，差异有统计学意义(P<0.05)。与DN组相比，DZ组大鼠的WBV、MPAs及WBRV均有明显改善，差异有统计学意义(P<0.05，表5)。

表2 各组大鼠体重比较(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

表2 各组大鼠体重比较(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

与O组比较，(1)P<0.05；与DN组比较，(2)P<0.05。

组别 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O组 359.00±10.75 382.00±11.60 438.40±22.55 469.00±18.77 523.80±18.40 DN组 321.80±11.17(1) 318.00±6.67(1) 316.20±11.95(1) 307.60±11.17(1) 306.60±8.32(1)DZ组 319.60±17.81(1) 327.80±14.17(1) 339.80±15.83(1)(2) 350.80±10.21(1)(2) 353.40±10.64(1)(2)F 13.18 46.94 69.90 180.08 375.99 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表3 各组大鼠血糖水平比较(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

表3 各组大鼠血糖水平比较(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

与O组比较，(1)P<0.01；与DN组比较，(2)P<0.01。

组别 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O组 4.80±0.89 4.86±0.71 4.90±1.07 4.82±0.38 4.46±0.43 DN组 21.18±1.10(1) 20.70±2.03(1) 20.28±1.51(1) 23.26±5.41(1) 20.40±1.72(1)DZ组 20.50±1.60(1) 20.26±1.54(1) 18.24±1.14(1)(2) 16.68±1.90(1)(2) 16.22±2.55(1)(2)F 174.97 222.93 39.65 106.28 48.22 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表4 各组大鼠血清生化指标比较(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

表4 各组大鼠血清生化指标比较(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

Scr. 血肌酐；BUN. 尿素氮；TC. 总胆固醇；TG. 三酰甘油；LDL-C. 低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C. 高密度脂蛋白胆固醇；与O组比较，(1)P<0.05；与DN组比较，(2)P<0.05。

组别 Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)O组 68.54±2.32 5.90±0.46 1.38±0.18 0.29±0.05 1.08±0.24 0.32±0.11 DN组 122.80±5.36(1) 31.42±4.07(1) 8.76±0.74(1) 2.71±0.14(1) 3.14±0.19(1) 1.78±0.29(1)DZ组 120.24±4.35(1) 25.92±3.67(1)(2) 7.26±0.44(1)(2) 1.80±0.09(1)(2) 2.36±0.30(1)(2) 1.76±0.15(1)F 596.21 201.46 664.29 158.40 199.50 202.19 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表5 各组大鼠血液流变学指标比较(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

表5 各组大鼠血液流变学指标比较(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

WBV. 全血黏度；MPAs. 血浆黏度；WBRV. 全血还原黏度；与O组比较，(1)P<0.05；与DN组比较，(2)P<0.05。

组别 WBV MPAs WBRV高切 中切 低切O组 2.58±0.07 3.19±0.11 0.62±0.07 9.72±0.11 1.42±0.12 DN组 5.32±0.17(1) 6.02±0.14(1) 1.72±0.16(1) 16.27±0.31(1) 3.17±0.08(1)DZ组 2.91±0.12(1)(2) 3.45±0.09(1)(2) 0.79±0.08(1)(2) 10.07±0.19(1)(2) 1.52±0.06(1)(2)F 27.62 69.27 70.92 23.47 58.91 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 讨 论

根据国际糖尿病联盟公布的最新数据，2019年全球约4.63亿成人患DM，预计到2045年，DM患者可能达到7亿，其中90%为2型DM[7]。DM并发症已成为严重的公众健康问题，其主要发生原因为微血管病变，而血液流变学改变和高血糖导致的内皮损伤是导致微血管病变的关键因素，在DN的发病机制中起重要作用[8-9]。因此，控制血糖、降低血液黏度是DN治疗的关键。

现代中医学将DN归属于“消渴”“消瘅”等范围，基本病机为气阴两虚、燥热内生[10]，同时认为血脂、血流变等指标变化反映了DN的瘀血阻络证候[11]。基于此，本研究选用滋脾通络方对DN大鼠进行治疗，其中黄芪、山药共为君药，黄芪甘温，补脾胃之气，山药甘平，补气养阴；当归、赤芍、川牛膝共为臣药，三种药物起到养血活血，抑制血小板聚集的作用；大黄、鬼箭羽、三七共为佐使，起到破瘀通络的作用[6]。

此前的大部分现代药理研究认为，黄芪及当归对D N 的治疗作用是通过抑制转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路，改善肾间质纤维化达成的。另外，黄芪及当归还具有改善微循环、抗血小板聚集、保护血管内皮细胞等功能[12-13]，山药多糖也具有降低血糖、血脂的作用[14]。本研究结果提示，滋脾通络方可明显降低DN大鼠的血液黏度、血脂及血糖水平，改善大鼠肾脏病理情况。其治疗DN的机制可能是通过改善大鼠的血液流变学及脂代谢，起到改善肾脏功能、降低血糖水平的作用。具体机制可能是滋脾通络方对血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)具有拮抗作用。TXA2是一种具有强烈促进血管收缩及血小板聚集作用的活性物质，在DN的发生发展中起重要作用。黄芪中的毛蕊异黄酮在中低剂量情况下可抑制TXA2的合成[15]，当归中的有效成分阿魏酸也可以选择性抑制TXA2合成酶活性，从而减少TXA2合成，抑制血小板聚集。

综上所述，滋脾通络方可通过改善血液流变学及脂代谢，发挥改善微循环、降低血糖水平、保护肾脏功能的作用。