赵宗霞，苏玉强，曾娟，双婷，陈必良

710038 西安，西安医学院第二附属医院 妇产科(赵宗霞、曾娟),麻醉科(苏玉强)； 710032 西安，第四军医大学西京医院 妇产科(赵宗霞、陈必良)；710000 西安，西安交通大学第一附属医院 妇产科(双婷)

卵巢癌是一种严重威胁全球妇女健康的恶性肿瘤。虽然其发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，但其死亡率在女性妇科肿瘤中最高[1]。卵巢癌在发病早期缺乏特异性的临床表现，导致大部分患者在诊断时就已处晚期并出现转移，导致预后极差[2]。研究表明，卵巢癌的发生发展是一个多因素影响的复杂病理过程，其中卵巢癌细胞的高转移性和侵袭性导致卵巢癌发生转移[3]，而肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)在卵巢恶性肿瘤的发生发展中发挥重要的促进作用[4]。TME是指由环绕在肿瘤组织周围的肿瘤细胞及相关成纤维细胞、巨噬细胞、间充质细胞及炎症相关因子等组成的生物环境[5]。卵巢癌具体的发病机制尚不完全明确，研究显示肝癌、结肠癌和胃癌等肿瘤组织中，肿瘤相关的成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)可以分泌细胞基质衍生因子、骨桥蛋白和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等细胞因子促进肿瘤细胞的增殖和迁移。HGF是一种可以促进肝细胞生长的细胞因子，有文献报道其在多种肿瘤组织中都异常高表达，促进肿瘤的发生发展[6]，但是HGF在卵巢癌中的表达及与卵巢癌发生发展的关系尚不明确。因此，本研究采用卵巢癌患者肿瘤组织、癌旁组织和正常卵巢组织及卵巢癌细胞系SKOV3细胞，探讨肿瘤相关成纤维细胞分泌的HGF与卵巢癌细胞增殖是否相关。

1 材料和方法

1.1 组织标本

本次研究共纳入本院妇产科2017年5月至2018年10月收治的49例卵巢癌患者及需妇科手术治疗的非卵巢癌患者40例。纳入标准：1)所有卵巢癌患者的临床表现和病理学检查结果均符合卵巢癌的诊断(依据《妇产科学》第8版)；2)卵巢癌患者均于我院首诊，且术前未经任何放化疗；3)病历资料完整。排除标准：1)依从性差；2)其他系统合并症；3)有绝对手术禁忌证。49例卵巢癌患者的年龄为32～69岁，平均年龄(41.82±7.35)岁。40例非卵巢癌患者年龄为31～71岁，平均年龄(45.28±5.91)岁。

1.2 材料

卵巢癌相关成纤维细胞(human endometrial carcinoma-1A cell,HEC-1A)、卵巢癌细胞SKOV3均购自中国科学院上海细胞典藏库；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、聚丙烯酸胺凝胶、结晶紫固体粉末购自广州科维生物技术有限公司；蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；DMEM培养液、胰蛋白酶及胎牛血清购自美国Hyclone公司；双抗及4%多聚甲醛购自西安科昊有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 本研究中收集的卵巢癌组织49例、癌旁组织(距肿瘤≥1 cm的正常卵巢组织)49例以及正常组织40例进行石蜡包埋切块。随后进行脱蜡和水化处理，抗原修复后滴加封闭液；1∶500稀释HGF一抗孵育；孵育结束后用PBS进行冲洗，加生物素标记的二抗进行孵育；PBS再次冲洗，滴加亲和素-过氧化酶溶液孵育。次日二氨基联苯胺显色液显色，苏木素染液复染，中性树胶固封；PBS作为一抗阴性对照组,结果判断采用半定量分析[7]。

1.3.2 CCK-8增殖实验 体外增殖实验分对照组和实验组；对照组：用RPMI-1640培养基调整SKOV3细胞浓度为5×104/mL，取200 μL细胞悬液加入96孔板；实验组，收集HEC-1A细胞培养48小时后的培养上清2 mL重悬SKOV3细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，取200 μL细胞悬液加入96孔板，每组6复孔，培养箱内分别培养12 h、36 h和48 h后加入CCK-8溶液10 μL，37°孵育1～4小时后在酶联免疫仪上选择450 nm波长测定吸光度值，计算每组浓度复孔的平均值。

1.3.3 平板克隆形成实验 取对数生长期的细胞，常规消化离心收集细胞沉淀，重悬细胞沉淀，进行细胞计数，调整SKOV3细胞浓度为1×103/mL，取150 μL细胞悬液(即150个细胞)接种至培养皿，补加培养基至10 mL，作为对照组。实验组收集HEC-1A细胞培养48小时后的培养上清2 mL，重悬SKOV3细胞，调整细胞浓度为1×103/mL，取150 μL细胞悬液接种至培养皿，补加HEC-1A培养上清至10 mL，在37℃、95%湿度、5%CO2培养箱培养15天，弃培养液，加入5 mL PBS洗剂2次，弃PBS，4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，0.1% 结晶紫染色20 min， 自来水冲洗，空气干燥，计算肉眼可见的克隆数。

1.3.4 细胞形态学和免疫荧光 取对数生长期SKOV3细胞，胰蛋白酶消化，细胞计数，调整细胞密度为5×105/mL，每孔2 mL细胞混悬液，直接接种至6孔板，作为对照组。实验组HEC-1A细胞与SKOV3细胞按1∶1的比例接种于Transwell小室上室，在37℃、95%湿度、5%CO2培养箱培养48 h后在倒置显微镜下观察SKOV3细胞形态变化，并进一步通过免疫荧光检测两组上皮细胞标志物上皮-钙粘素的表达。

1.3.5 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 取对数生长期SKOV3细胞，胰蛋白酶消化，细胞计数，调整细胞密度为5×105/mL，每孔2 mL细胞混悬液，直接接种至6孔板，作为对照组。实验组HEC-1A细胞与SKOV3细胞按1∶1的比例接种于Transwell上室，在 37℃、95%湿度、5%CO2的培养箱培养48 h后收集两组细胞培养液，低温离心，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测培养液中HGF的含量。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原蛋白(Collagen I)在卵巢癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达情况

首先，免疫组织化学染色检测CAF标志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌患者3种不同组织中的表达情况，结果显示α-SMA和Collagen I在卵巢癌中的表达明显高于癌旁组织和正常组织 (***P<0.001)(图1)。

图1 肿瘤相关成纤维细胞标志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌患者组织中的表达

Figure 1. Expression of α-SMA and Collagen I in Tissue of Patients with Ovarian Cancer

2.2 HEC-1A细胞培养上清促进SKOV3 细胞增殖

为了体外验证肿瘤相关成纤维细胞是否对卵巢癌起到促癌作用，体外我们将卵巢癌相关成纤维细胞HEC-1A培养48小时后的培养上清孵育卵巢癌细胞SKOV3。结果表明用HEC-1A细胞培养上清处理后的SKOV3 细胞培养36 h和48 h后，增殖能力显著增强 (*P<0.05,**P<0.01)(图2)。

图2 HEC-1A培养上清对SKOV3 细胞增殖能力影响

Figure 2. Effect of HEC-1A Supernatant on the Proliferation of SKOV3 Cells

2.3 HEC-1A细胞培养上清促进SKOV3 细胞克隆形成能力

为了进一步验证肿瘤相关成纤维细胞对卵巢癌的促癌作用。我们用克隆形成实验检测了HEC-1A细胞培养上清培养SKOV3细胞后克隆形成能力的变化。结果显示HEC-1A培养上清培养后，SKOV3 细胞克隆形成能力明显增强，差异具有统计学意义(***P<0.001)(图3)。肿瘤成纤维细胞可以促进卵巢癌细胞的增殖作用。

图3 HEC-1A细胞培养上清对SKOV3 细胞克隆形成能力影响

Figure 3. Effect of HEC-1A Supernatant on Clone Formation Ability of SKOV3 Cells

2.4 HEC-1A细胞共培养后促进SKOV3上皮样细胞增多

肿瘤相关成纤维细胞分泌的相关因子，对肿瘤细胞的形态具有一定的诱导作用，具体表现为肿瘤细胞上皮样细胞增多，从而导致其增殖和迁移能力增强。为了观察肿瘤相关成纤维细胞对卵巢癌细胞形态变化的影响，将SKOV3细胞与HEC-1A细胞共培养后，在倒置显微镜下观察SKOV3细胞的形态变化，结果发现共培养后卵巢癌SKOV3细胞呈上皮样细胞形态明显增多，并聚集成簇(图4)。并进一步通过免疫荧光检测了两组上皮细胞标志物上皮-钙粘素的表达，结果显示HEC-1A培养上清处理组细胞的表达明显高于未处理组 (P<0.01)(图5)，这说明肿瘤相关成纤维细胞可以激活卵巢癌细胞的增殖和迁移能力。

图4 HEC-1A细胞共培养对SKOV3 细胞形态变化影响

Figure 4. Effect of HEC-1A Co-Cultured with SKOV3 on Morphological Changes of SKOV3 Cells

图5 E-cadherin在HEC-1A培养上清处理组和未处理组SKOV3细胞中的表达

Figure 5. Expression of E-cadherin in HEC-1A Supernatant Treated and Untreated SKOV3 Cells

2.5 HEC-1A细胞共培养后SKOV3 细胞培养液HGF表达明显增高

为了研究肿瘤相关成纤维细胞是否通过分泌HGF来促进卵巢癌细胞的增殖能力，ELISA检测了共培养前后SKOV3 细胞培养液HGF的表达情况。结果显示共培养后SKOV3 细胞培养液HGF表达明显高于对照组SKOV3 细胞，差异具有统计学意义(P<0.001)(图6)。说明肿瘤相关成纤维细胞可能通过分泌HGF促进了卵巢癌的增殖作用。

图6 Elisa检测HEC-1A细胞共培养后SKOV3 细胞培养液中HGF表达变化

Figure 6. Changes of HGF Expression in the Supernatant of HEC-1A Co-Cultured with SKOV3 Detected by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科肿瘤相关死亡第一位。卵巢癌早期由于缺乏特异性的临床表现和诊断方法，导致诊断时已处于晚期并合并其他脏器的转移，5年生存率约40%，复发率约80%，预后差[8-9]。癌转移是死亡的重要原因，高复发率和高耐药率是导致该疾病高死亡率的最重要原因。因此，探究卵巢癌发生机制及如何改善早期卵巢癌检测的筛查方法就显得尤为重要。

尽管对癌细胞进行了广泛的研究，但目前研究表明癌症的进展主要取决于个体的生物学行为，这些行为是通过癌细胞与TME之间的相互作用来调节的[10]。 大量研究表明，TME在不同肿瘤进展中具有关键作用[11-13]。TME本质上是异质性的，包含周围的细胞外基质和几种不同类型的细胞，包括CAF、内皮细胞、免疫细胞、局部和骨髓来源的基质干细胞和祖细胞[14]。几种因素介导CAF的分化，某些标记物包括α-SMA、成纤维细胞活化蛋白和血小板衍生生长因子受体α/β，已被用于区分CAF和其他类型的成纤维细胞[15-17]。

有研究报道肿瘤相关成纤维细胞可以分泌骨桥蛋白和肝细胞生长因子从而促进胃癌细胞的增殖和转移[18]。同时有文献报道在结肠癌组织中的肿瘤相关成纤维细胞分泌的肝细胞生长因子能够刺激结直肠癌细胞衍生为肿瘤干细胞，导致其促进了结直肠癌细胞的增殖、转移和侵袭能力[19]。HGF是一种生理状态下由间质细胞产生的具有多功能的细胞生长因子，与其特异性受体酪氨酸蛋白激酶Met结合后可以发挥多种生物学功能，例如：促进恶性肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤组织血管和淋巴管的生成等[20]。

本研究首先通过检测肿瘤相关成纤维细胞标志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌组织、癌旁组织及正常卵巢组织中的表达，发现其在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织和正常卵巢组织，表明肿瘤相关成纤维细胞可能与卵巢癌的发生发展关系密切。随后通过体外CCK-8实验和克隆形成实验显示肿瘤相关成纤维细胞促进SKOV3 细胞的增殖能力。此外，肿瘤相关成纤维细胞和卵巢癌细胞共培养后SKOV3 细胞培养液中HGF的表达明显增高，进一步说明卵巢癌相关成纤维细胞可能通过分泌HGF促进了卵巢癌细胞的增殖能力。

综上所述，肿瘤相关成纤维细胞可能通过分泌HGF促进卵巢癌细胞增殖能力，与卵巢癌的发生发展相关。而卵巢癌患者体内肿瘤相关成纤维细胞来源何处，HGF是否还有下游调控因子来调控卵巢癌的发生发展均有待于进一步的研究证实。

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