张朦朦，刘雪娜，来永巍，刘 玥，何红鹏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457)

宫颈癌是世界范围内威胁女性健康的第二大恶性肿瘤，我国每年约有10万新发病例[1]．宫颈癌的发病与高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染密切相关，HPV病毒 DNA存在于约97%宫颈癌细胞中[2]．应用 siRNA、shRNA 以及CRISPR-CAS9敲减或敲除宫颈癌细胞中 HPV基因可抑制癌细胞生长，因此 HPV基因成为宫颈癌治疗的靶标[3-6]．

在哺乳动物细胞中，染色质的最小结构单位是核小体，由组蛋白和 DNA构成．细胞内组蛋白存在乙酰化等多种形式的翻译后修饰，这些翻译后修饰对基因表达发挥调控作用．细胞内蛋白质乙酰化和去乙酰化过程分别由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase complex，HDAC)催化[7]．

在宫颈癌细胞中，HDAC表达水平升高活性增强，促进细胞癌变．因此，HDAC抑制剂是具有抗癌潜能的药物[8-9]．SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)又称伏立诺他(vorinostat)，是美国 FDA批准用于皮肤 T细胞淋巴瘤治疗的 HDAC抑制剂.在宫颈癌领域，多个研究发现 SAHA与常规化疗药物或放疗方法联合应用时能增强癌细胞对化疗及放疗的敏感性，抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡[10-13].但是，SAHA单独应用在宫颈癌细胞中会产生怎样的生物学效应，特别是对细胞衰老和迁移的影响，目前没有文献报道．

鉴于 HPV基因对宫颈癌的重要性，本实验室前期研究了 SAHA对宫颈癌细胞中 HPV基因表达的影响，发现SAHA抑制HPV基因表达并引起细胞周期阻滞[14]．然而，SAHA 对宫颈癌其他癌细胞表型的作用并不明确，因此，本课题从细胞凋亡、细胞衰老和细胞迁移这些方面进行深入研究．

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌细胞 HeLa来自美国 ATCC．胎牛血清，天津康源生物技术有限公司；细胞完全培养基DMEM-LG，美国Gibco公司；SAHA，美国 Sigma公司；p21抗体、十字孢碱(ST)及细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；Trizol试剂、M-MLV逆转录试剂盒，美国 Invitrogen公司；Fluorometric TUNEL System试剂盒，Promega公司；SYBR Green染料，德国DBI 公司；青霉素、链霉素、胰酶及 RNase A，北京索莱宝科技有限公司；MYL9抗体、β-actin抗体，Santa Cruz公司；山羊抗兔荧光二抗、山羊抗鼠荧光二抗，美国LI-COR公司．

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

宫颈癌 HeLa细胞培养于含 10%胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素的 DMEM-LG培养基，在 37℃、5% CO2恒温培养箱中进行贴壁培养．待细胞汇合度达到 70%～80%时，采用 0.25%胰酶温和消化传代．

1.2.2 台盼蓝染色计细胞数

等量的HeLa细胞接种于6孔板，加药处理24h后用胰酶消化下来制备成单细胞悬液，并适当稀释．细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9﹕1混匀，孵育3min后，在显微镜下用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染．

1.2.3 β-半乳糖苷酶法检测细胞衰老

HeLa细胞用 SAHA处理 72h后，用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，按说明书检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性．用染色固定液室温固定 15min，PBS漂洗后加入含有 X-Gal的染色工作液，37℃孵育过夜．在光学显微镜下观察并拍照．

1.2.4 免疫印迹(Western blot)分析

提取细胞总蛋白，进行琼脂糖凝胶电泳(SDSPAGE)检测．通过半干电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素膜．用封闭液室温封闭 1h，继之分别用 p21抗体、MYL9抗体、β-actin抗体孵育，4℃过夜，洗膜后加入相对应的二抗(山羊抗兔荧光二抗、山羊抗鼠荧光二抗)室温避光孵育 1.5～2h，洗膜 3次，用Odyssey成像系统扫膜．

1.2.5 PCR检测

4℃条件下用 Trizol裂解细胞，提取总 RNA，进行逆转录得到 cDNA，随后进行常规 PCR或实时荧光定量PCR(Real-time PCR)．引物序列为GAPDH：上游 5'-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3'；18SrRNA，上游5'-CACGGGAAACCTCACCCGGG-3'，下游 5'-CGGG TGGCTGAACGCCACTT-3'；MYL9，上游 5'-ATTCA ACGGCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGG CGGAGATGA-3'；p21，上游 5'-GACACCACTGGAG GGTGACT-3'，下游 5'-CAGGTCCACATGGTCTTCC T-3'．PCR 反应条件：95℃ 5min；95℃变性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，28次循环；72℃10min．Real-time PCR 反应条件：95℃预变性2min；95℃变性 10s，60℃退火 30s，95℃延伸1min，40个循环；95℃ 10s 终止反应并以 ΔΔCt法对结果进行计算．

1.2.6 细胞划痕实验

将状态良好的 HeLa细胞接种于 24孔板，培养24h后用小号枪头划线，用PBS洗2次，去除划下来的细胞，然后加入5µmol/L SAHA继续培养，36h后显微镜下观察并拍照．用 Image J软件测量划痕宽度，按照式(1)计算细胞迁移率．

1.2.7 Transwell细胞迁移实验

计数 5×105个 HeLa细胞，用含有 SAHA的无血清培养基悬浮并加入到 Transwell上室中，下室加入含有 10%血清的培养液，培养 10h．取上层小室，用棉签擦去滤膜正面的细胞，再用含 4%多聚甲醛溶液固定滤膜底面的细胞，DAPI溶液染核，通过激光扫描共聚焦显微镜对至少 5个视野照相．相对细胞迁移率按照式(2)计算．

1.2.8 TUNEL法检测细胞凋亡

加药处理 HeLa细胞，DMSO作为阴性对照组．24h后，按照Fluorometric TUNEL System试剂盒的步骤处理细胞，荧光显微镜下观察并拍照．

1.3 统计分析

实验数据使用 SPSS v13.0软件处理，各组实验数据以“平均值±标准差”表示．组间统计学差异分析采用 t检验，*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01．

2 结果与分析

2.1 SAHA对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

SAHA处理HeLa细胞24h后，显微镜下观察细胞密度和形态学变化．十字孢碱(ST)可以诱导肿瘤细胞凋亡，用作阳性对照．结果显示，与未加药组或DSMO组相比，SAHA组细胞密度小，细胞面积变大，细胞伪足变尖(图 1)．而十字孢碱处理组细胞密度也减小，但细胞体积变小、形态变圆，与 SAHA 处理的细胞明显不同．

图1 加药处理后HeLa细胞的形态学变化Fig. 1 Morphological changes of HeLa cells after SAHA or ST treatment

为了定量分析 SAHA对宫颈癌细胞的作用，利用台盼蓝染色法进行活细胞计数，结果如图 2所示．SAHA抑制 HeLa细胞的增殖，并且随着 SAHA浓度的加大，活细胞数目逐渐减少；当SAHA浓度为5µmol/L时，活细胞数目约为空白对照组的50%．以上结果表明：SAHA抑制宫颈癌HeLa细胞增殖．

图2 台盼蓝染色法计数 SAHA处理后 HeLa活细胞的数量Fig. 2 Quantification of viable HeLa cells after SAHA treatment

2.2 SAHA对p21基因表达的影响

真核细胞的增殖周期受到多种因素调控．p21蛋白对细胞增殖周期起负调控作用，引起细胞周期阻滞．为了探究 SAHA抑制细胞增殖与 p21基因表达的关系，用不同浓度 SAHA处理 HeLa细胞 24h，然后提取 RNA，利用 RT-PCR和 Real-time PCR检测p21的mRNA水平，结果如图3所示．

图3 SAHA上调p21基因表达Fig. 3 Expression of p21 increased after SAHA treatment

p21mRNA水平随 SAHA浓度升高逐渐上调，与常规 PCR结果一致．Real-time PCR结果显示：SAHA处理后p21mRNA水平升高约16倍．用不同浓度SAHA处理HeLa细胞48h后裂解细胞提取总蛋白，Western blot检测p21蛋白水平结果显示：p21蛋白随着SAHA浓度的增加而增加．可见，SAHA引起 HeLa细胞中 p21基因表达的上调，从而阻滞了HeLa细胞周期，最终抑制HeLa细胞增殖．

2.3 SAHA对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

本实验利用TUNEL法检测SAHA处理的HeLa细胞是否会发生凋亡，十字孢碱(ST)处理组为阳性对照组，DMSO组为阴性对照组，结果如图 4所示．加药处理 24h后，ST处理组细胞核内出现绿色荧光，表明ST诱导Hela细胞发生凋亡；而SAHA处理组与 DMSO对照组 TUNEL染色均为阴性，说明无细胞凋亡现象．以上结果表明：SAHA并不会引起HeLa细胞凋亡．

图4 TUNEL法检测SAHA处理对HeLa细胞凋亡的影响Fig. 4 TUNEL assay determining the apoptosis of HeLa cells following SAHA treatment

2.4 SAHA诱导HeLa细胞衰老

细胞衰老受到p53-p21信号通路的调节[15]．图1显示SAHA处理后HeLa细胞贴壁良好，体积变大，形态改变，符合细胞衰老的特点．图3显示SAHA上调 p21基因表达．这些实验结果提示 SAHA可能诱导细胞衰老．

检测细胞衰老的主要方法是 β-半乳糖苷酶染色法．衰老相关 β-半乳糖苷酶在 pH 6.0左右有活性，催化 X-Gal发生颜色反应，使衰老细胞蓝染．用5µmol/L SAHA处理HeLa细胞72h，结果如图5所示．SAHA组多数细胞内生成的蓝色产物证明细胞内衰老相关 β-半乳糖苷酶活性提高，而 DMSO组多数细胞内没有蓝染，仅个别细胞内和细胞间隙出现蓝色，蓝染的细胞数量和染色程度远低于 SAHA处理组．此结果证明SAHA诱导HeLa细胞发生衰老．

图5 衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老Fig. 5 Examination of cell senescence with β-galactosidase staining method

2.5 SAHA抑制HeLa细胞迁移能力

恶性肿瘤细胞迁移能力增强会导致肿瘤转移.为观察 5µmol/L SAHA对 HeLa细胞迁移能力的影响进行划痕实验，结果如图6所示．

图6 划痕实验检测SAHA对HeLa细胞迁移能力的影响Fig. 6 Measuring the effect of SAHA on the migration of HeLa cells with scratch wound-healing assay

36h时对照组细胞的划痕几近愈合；而此时SAHA组细胞划痕明显没有愈合．Image J软件定量分析，SAHA组细胞划痕愈合能力明显减弱，细胞迁移率下降了 40%左右，说明 SAHA能够抑制 HeLa细胞的迁移能力．

划痕实验结果表明 SAHA抑制 HeLa细胞的水平方向迁移，为探究 SAHA是否也可以影响细胞空间迁移能力，采用 transwell实验进行验证，结果如图7所示．由图7(a)可见，与DMSO组相比，加药组的细胞穿过小室滤膜从滤膜正面迁移到底面的数量明显减少．图7(b)结果显示，SAHA处理后细胞迁移率下降 70%，与划痕实验结果一致．综合细胞划痕和transwell实验结果表明，SAHA抑制HeLa细胞的迁移能力．

图7 Transwell法检测 SAHA对 HeLa细胞迁移能力的影响Fig. 7 Effects of SAHA on the migration of HeLa cells determined with Transwell assay

2.6 SAHA对迁移相关基因表达的影响

MYL9即肌球蛋白轻链 9，是细胞骨架结构的重要组分，参与细胞的运动与形态变化，影响细胞迁移能力．为了揭示SAHA抑制HeLa细胞迁移的机制，本实验使用不同浓度 SAHA处理细胞，利用 RTPCR、Real-time PCR和 Western blot的方法检测了MYL9在RNA水平与蛋白水平的表达情况，结果如图8所示．由图8可知：SAHA下调MYL9mRNA水平且呈现浓度依赖性；Real-time PCR结果与RT-PCR结果一致，5µmol/L SAHA 处理后 HeLa细胞中MYL9mRNA水平下降约60%；Western blot结果显示，MYL9蛋白水平随 SAHA浓度增加而逐渐下降．以上实验结果证明，SAHA抑制迁移相关基因MYL9的表达．

图8 SAHA抑制迁移相关基因MYL9表达Fig. 8 Expression of the migration-related MYL9 gene decreased after SAHA treatment

3 讨 论

为了探究以SAHA为代表的HDAC抑制剂的抗宫颈癌作用，本课题通过细胞和分子水平的实验证明SAHA抑制宫颈癌HeLa增殖而不引起细胞凋亡；同时，SAHA上调衰老相关β-半乳糖苷酶活性，诱导细胞衰老；下调迁移相关基因MYL9表达，降低细胞迁移能力．已往研究多数关注 SAHA对细胞增殖和凋亡的影响，SAHA与其他放疗、化疗联合应用时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡．而本文发现SAHA本身并不促进 HeLa细胞凋亡，而是诱导 HeLa细胞衰老和抑制HeLa细胞迁移．宫颈癌等恶性肿瘤导致病人死亡的主要原因是肿瘤细胞从原发灶转移至肺、脑等重要脏器破坏其功能．SAHA降低宫颈癌HeLa细胞迁移能力，提示 SAHA可能降低宫颈癌细胞转移的机率，是潜在的抗宫颈癌药物．

细胞衰老指细胞增殖和分化能力及生理功能发生衰退，可发生于非肿瘤细胞，也可以发生于肿瘤细胞．当正常细胞受到损伤时，细胞衰老可以防止损伤细胞增殖和癌变．恶性肿瘤细胞增殖能力显著强于正常细胞，一般不发生衰老．应用放化疗方法治疗肿瘤时，大量的损伤可诱导肿瘤细胞发生衰老[16]．这种治疗相关的肿瘤细胞衰老一方面可以抑制肿瘤细胞增殖，达到抗癌效果；另一方面，衰老的细胞保持了产生细胞因子的能力，可能因此改变肿瘤微环境，促进免疫系统清除肿瘤细胞．另外，也有研究认为这种衰老却不死亡的肿瘤细胞在治疗结束后可能成为肿瘤复发的原因[16-18]．肿瘤治疗相关的细胞衰老对疗效的影响目前还不确定，本研究发现 SAHA单独使用诱发细胞衰老而不是凋亡，所以，在应用SAHA治疗宫颈癌时应考虑其诱导细胞衰老现象，制定合理治疗方案．

目前发现的HPV病毒有100多种亚型，根据是否致癌，可分为低危型和高危型HPV．导致宫颈癌的高危型HPV亚型包括16型、18型、52型等，其中16型和18型HPV在宫颈癌组织的阳性率超70%[19-20]，因此宫颈癌研究多以携带16型或18型HPV的细胞系为模式细胞，本研究选择的是携带HPV18的HeLa细胞系．为了验证 SAHA对宫颈癌的抑制作用是否也适用于携带其他 HPV亚型的癌细胞，下一步工作将对携带 HPV16的 CaSki、SiHa等宫颈癌细胞系进行检测，并计划在动物水平检测 SAHA的抗宫颈癌作用．通过分子、细胞和动物水平的研究，为研发具有抗宫颈癌作用的SAHA及其衍生物奠定理论基础.