杨小芳 王茹 何鹏彬

摘要 目的：利用液相-质谱联用技术的代谢组学方法研究冠心病心绞痛气滞血瘀证和气虚血瘀证患者血清中氨基酸内源性代谢物的变化。方法：选取2018年3月至2019年2月中国中医科学院西苑医院收治的稳定型冠心病心绞痛患者60例作为研究对象，其中包括气滞血瘀证30例和气虚血瘀证30例，以及对照组30例，以液相-质谱联用为技术平台，通过多反应监测扫描模式，检测血清样本中20种氨基酸含量，同时进行偏最小二乘法判别分析及差异代谢物的分析。结果：根据PLS-DA图显示对照组与冠心病不同证型之间氨基酸代谢轮廓明显不同，其中冠心病组缬氨酸、组氨酸、鸟氨酸等多种氨基酸较对照组含量升高，而γ-氨基丁酸与谷氨酰胺含量降低。气滞血瘀组和气虚血瘀组的差异代谢物主要有组氨酸，瓜氨酸等，且2种证型中气虚血瘀组中含量较高。结论：冠心病心绞痛气滞血瘀证和气虚血瘀证中的氨基酸代谢机制紊乱，为区分冠心病中医证型提供了一定的科学依据。

关键词 代谢组学;氨基酸;冠心病心绞痛;气滞血瘀证;气虚血瘀证

Abstract Objective：To study the changes of amino acid endogenous metabolites in the serum of patients with qi stagnation and blood stasis syndrome（QS），qi deficiency and blood stasis syndrome（QD）of coronary heart disease（CHD）with angina pectoris using LC-MS.Methods：A total of 60 patients with stable coronary heart disease and angina pectoris admitted to Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences from March 2018 to February 2019 were selected，including 30 patients with qi stagnation and blood stasis syndrome，30 patients with qi deficiency and blood stasis syndrome，and 30 patients in the control group.Using LC-MS as the technology platform，the multi-reaction monitoring scanning mode was used to detect the content of 20 amino acids in serum samples，and the partial least squares discriminant analysis and differential metabolite analysis were also performed.Results：According to the PLS-DA，the amino acid metabolism profile between the control group and different syndromes of CHD was completely different.The contents of valine，histidine，ornithine and other multiple amino acids in the group of patients with CHD were significantly higher than the control group，while the content of γ-aminobutyric acid and glutamine decreased.Differential metabolites mainly include histidine，citrulline，etc.in and QS and blood stasis group and QD and blood stasis group，with QD containing the more.Conclusion：The amino acid metabolism in patients with CHD and angina pectoris QS and blood stasis and QD syndrome and blood stasis was disordered which provided a scientific basis for distinguishing TCM syndromes of CHD.

Keywords Metabolomics; Amino acids; Coronary heart disease angina pectoris; Qi stagnation and blood stasis syndrome; Qi deficiency and blood stasis syndrome

據流行病学研究分析，冠心病是危害人类身体健康的主要疾病之一，其发病年龄日渐年轻化，发病率总体呈持续上升趋势[1]。《中国心血管病报告2018》概要揭示，心血管病死亡率居首位，高于肿瘤及其他疾病，占居民病死的40%以上[2]。中医在治疗冠心病方面积累了丰富的经验，而冠心病中医分型又以血瘀证为多，约占70%[3]，由于各证型之间常互兼夹，临床的辨证论治则难度较大。代谢组学研究具有整体、动态、综合与分析的特点，能够从代谢网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平，与中医学的系统观、整体观相近[4]。靶向代谢组学的发展使得我们更清楚的看到某一类代谢物的变化情况。内源性小分子氨基酸与心血管疾病有重要的联系[5]，因此本研究基于实验室前期氨基酸靶向代谢组学的研究成果[6]，开展了稳定型冠心病心绞痛气滞血瘀合气虚血瘀患者的血清中靶向20种氨基酸的定量研究，从内源性小分子氨基酸水平上探讨其机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月至2019年2月中国中医科学院西苑医院收治的稳定型冠心病心绞痛患者60例作为研究对象。对照组经普通体检及实验室检查排除肝肾、心脑血管等疾病的健康志愿者，对照组中男17例，女13例，年龄48～75岁，平均年龄（60.3±1.0）岁;气滞血瘀组中男16例，女14例，年龄44～75岁，平均年龄（61.9±1.4）岁;气虚血瘀组中男16例，女14例，年龄48～74岁，平均年龄（63.3±1.3）岁。3组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。受试者于空腹抽取肘静脉血置于真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min（离心半径81 mm）离心10 min，取上层血清，并置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 诊断标准 1）西医诊断标准：参考国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》[7]及欧洲心脏病学会2013年发布的《欧洲心脏病学会稳定型冠状动脉疾病管理指南》[8]。2）中医诊断标准：疾病及证型诊断参照中国中医药管理局制定的《2014版各科诊疗方案》中的“胸痹心痛病”（慢性稳定型心绞痛）中医诊疗方案。

1.3 纳入标准 住院患者，年龄在40～75岁之间;经冠状动脉造影检查，符合稳定性冠心病心绞痛诊断者;中医辨证为气滞血瘀证、气虚血瘀证的患者;患者自愿签订知情同意书者。

1.4 排除标准 血压控制不良患者、严重糖尿病代谢综合征患者;患有严重慢性心力衰竭、严重心律失常或安装有心脏起搏器、心肌梗死病史的患者;患者有活动性消化道溃疡和其他出血性疾病的存在;患有恶性肿瘤，自身免疫性疾病或血液疾病患者。

1.5 研究方法

1.5.1 仪器与试剂 Waters超高效液相-三重四级杆质谱仪（美国waters公司，型号：XEVO TQ-S）;乙腈及甲酸（美国fisher公司，货号：A456-4和A113-50）;甲酸铵（美国Sigma公司，货号：70221）;甘氨酸（货号：G8898）、β-丙氨酸（货号：146064）、丙氨酸（货号：A7627）、γ-氨基丁酸（货号：A2129）、丝氨酸（货号：S4500）、缬氨酸（货号：855987）、苏氨酸（货号：T8625）、牛磺酸（货号：T0625）、亮氨酸（货号：L8000）、异亮氨酸（货号：I2752）、反式-羟脯氨酸（货号：56250）、天冬酰胺（货号：A0884）、鸟氨酸（货号：W419001）、赖氨酸（货号：L5501）、甲硫氨酸（货号：M9625）、苯丙氨酸（货号：P1751）、1-甲基-组氨酸（货号：67520）、瓜氨酸（货号：C7629）、色氨酸（货号：T0254）均购于美国sigma公司;谷氨酰胺（货号：A0784）、组氨酸（货号：A0698）购于日本TCI公司;氨基酸内标（货号：NSK-1）购自于美国CIL（Cambridge Isotope Laboratories）公司，其中该内标包含11种同位素氨基酸;超纯水为Milli-Q system超纯水纯化系统。

1.5.2 对照品溶液的制备 精密称取上述氨基酸对照品1 mg置1.5 mL的EP管中，溶解得到1 mg/mL的标准溶液，摇匀放入4 ℃冰箱备用。

1.5.3 血液样本的处理 将血清放置4 ℃冰箱解冻，振荡混合均匀，取样4 μL装于1.5 mL的离心管中，然后加入991 μL提取液及5 μL内标液（NSK-1内标液稀释50倍），涡旋混合1 min，4 ℃下12 000 r/min（r=84 mm）离心5 min，取上清液于进样小瓶内待测[5]。

1.5.4 色谱条件 超高效液相色谱ACQUITY BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A：乙腈（含0.2%甲酸和1 mmol甲酸铵）;流动相B：超纯水（含0.1%甲酸和1 mmol甲酸铵）;梯度洗脱：（0.0 min，85%A;5.5 min，80%A;12.5 min，60%A;13.5 min，85%A;15 min，85%A），柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL。

1.5.5 质谱条件 Waters三重四级杆质谱（TQ-S）仪：采用正离子模式多反应监测进行采集;毛细管电压为0.4 KV;锥孔电压为20 V。离子源温度为150 ℃;去溶剂气温度为400 ℃;去溶剂气流量为800 L/h;锥孔气流量为150 L/h。各氨基酸对应的母子离子对，锥孔电压及碰撞能量以发表。数据分析利用MassLynx V 4.1对采集得到的谱图进行离子对的积分等操作。

1.6 统计学方法 将得到的积分数据进行统计学分析，每一行代表一个样本，每一列代表一种化合物，数值即为此化合物在样本中的含量。以Excel形式保存，用于模式识别分析。将其Excel导入至SIMCA-P软件（13.0）进行建模判别分析，模式识别采用偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。之后将测得的20种靶向氨基酸进行方差分析（P<0.05认为差异有统计学意义），找出显著性差异的代谢差异物，从内源性小分子氨基酸水平上探讨其机制。

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围 将氨基酸类标准储备液（1 mg/L）用配制的提取液稀释配制成标准溶液系列，线性范围见表1，在上述仪器条件下分析。各氨基酸与内标物的峰面積比值（Y）为纵坐标，以浓度（pg/μL）为横坐标（X）进行线性回归，得到标准曲线，线性关系良好，回归方程和相关系数见表1。以3倍信噪比（S/N）估算方法检测限，以10倍信噪比（S/N）估算方法定量限，结果见表1。

2.2 气滞血瘀证与气虚血瘀证患者血样氨基酸代谢组学研究 为了更清楚的表达氨基酸内源性代谢轮廓，偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）方法能够很好的解决无监督分析中组间差异不明晰的问题，从PLS-DA图（图1）中可以看出图中的每一个点代表一个样本，患有稳定型心绞痛的冠心病患者的代谢状态与对照组的代谢状态明显不同，冠心病心绞痛气滞血瘀证和气虚血瘀证氨基酸代谢轮廓也存在明显不同，再对其血样中的含量进行统计学分析。由表2可以看出，对照组，气滞血瘀组与气虚血瘀组患者体内氨基酸的含量变化情况，大多数氨基酸在冠心病心绞痛患者血清中含量较高，且有显著性差异（组氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、亮氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-组氨酸、瓜氨酸），2种氨基酸（谷氨酰胺、γ-氨基丁酸）较对照组降低，且差异有统计学意义。见图2。本研究根据不同证型氨基酸代谢物的变化来阐明中医“证候”的调节机制。所有采集的数据对不同证型的代谢标志物进行区分，从靶标代谢组学研究筛查出与心力衰竭相关氨基酸小分子标志物分析研究，涉及到上述氨基酸代谢通路，说明冠心病心绞痛患者的氨基酸代谢是紊乱的，同时不同证型的氨基酸代谢通路机制上也存在一定差异。

3 讨论

本研究利用LC-MS技术对冠心病气滞血瘀证及气虚血瘀证患者的血清样本进行氨基酸代谢组学分析，探索2种证型血清中20种氨基酸的代谢情况。发现冠心病血清样本中组氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、亮氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-组氨酸较对照组含量升高，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸较对照组降低。在心肌受损的情况下，ATP合成减少，心肌耗氧量增加。支链氨基酸中的亮氨酸与缬氨酸均可转化成糖和脂质，为机体提供能量[9]。因此，这些代谢物含量升高是为了适应机体的应急反应。组氨酸可以在组氨酸脱羧酶的催化下生成组胺，过多的组胺可诱发冠脉收缩，冠脉血流减少，加重心肌缺血[10]。甲硫氨酸增加会导致内皮功能受损、血管舒缩功能减弱，增加冠心病发病的风险[11]。甲硫氨酸通过转硫作用生成牛磺酸，牛磺酸含量显著升高[12]。冠心病患者机体代谢发生障碍，鸟氨酸循环被激活，导致尿素及鸟氨酸积累。瓜氨酸是从鸟氨酸及胺基甲醯磷酸盐在尿素循环中生成，因此鸟氨酸的增加导致瓜氨酸含量也显著增加。而生糖氨基酸谷氨酰胺可通过谷氨酰胺异化转化成糖，为机体提供能量[13]。丙氨酸升高使无氧代谢增强，造成ATP合成减少[14]。γ-氨基丁酸能够扩张血管，防止动脉硬化等作用，冠心病患者血样中γ-氨基丁酸含量显著降低。甘氨酸在丝氨酸经甲基转移酶的催化下，由丝氨酸合成，甘氨酸含量降低[15]，提示丝氨酸合成甘氨酸的过程受到阻碍，造成丝氨酸含量的积累。2种证型之间的差异物主要为组氨酸及瓜氨酸，且气虚血瘀证升高的更为明显，提示冠心病心绞痛气滞血瘀及气虚血瘀患者机制主要相关是组氨酸和瓜氨酸的代谢通路上，为更好区别两证型还需要进一步的其他类别内源性小分子的差异分析。

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