王晶淼 赵柏萍

摘 要 黑曲霉具有完善和强大的蛋白翻译以及修饰功能，可安全高效的表达同源或外源基因，是一个重要的重组蛋白表达系统。但是在表达外源蛋白时表达量较少，蛋白折叠机制饱和或蛋白质折叠错误被认为是外源蛋白质分泌表达的一个重要瓶颈。异源蛋白的不正确折叠会引发非折叠蛋白响应，从而使与蛋白折叠、分泌和降解有关基因上调。通过激活非折叠蛋白响应相关基因可以增加某些蛋白质的分泌表达量，但是对其规律和机制还缺乏深入系统的认识。本文章主要从黑曲霉的表达系统及限速步骤，非折叠蛋白响应及其相关调控基因，黑曲霉表达内源蛋白及外源蛋白的研究进展等内容进行研究。

关键词 非折叠蛋白响应;黑曲霉;分泌表达蛋白

引言

黑曲霉分泌表达外源基因与表达内源基因相比较表达量较少，通过不同途径可以提高外源蛋白的表达量和分泌量，可以使黑曲霉表达外源蛋白的量与表达同源蛋白达到相当的水平。而在分泌途径中，未折叠蛋白反应的激活及其相关的基因对其的调控对外源蛋白的表达分泌有积极的作用。本论文通过对黑曲霉的表达系统及限速步骤的研究和对非丝状真菌非折叠蛋白响应的研究来阐述非折叠蛋白响应相关基因对黑曲霉分泌表达蛋白的影响。

1黑曲霉的表达系统及限速步骤

黑曲霉是非常常见的一种真菌，形状呈现丝状，其在对非丝状真菌的蛋白基因进行表达方面体现出了非常好的性能，同时在蛋白分泌、表达以及修饰方面也取得了非常好的效果，重组体在遗传方面具有的特性非常稳定。除此之外，黑曲霉在蛋白表达方面能够获得非常高的产量，胞外分泌率相对比较高，并且其对蛋白质进行折叠和修复的系统和真核细胞非常相近，以上的种种特性使得黑曲霉变成一种非常有前景的能够生产异源蛋白的能够对宿主进行表达的系统。相比较而言， 使用细菌在对蛋白质进行表达方面存在比较多的缺陷，使用细菌进行表达时产生的蛋白质往往是以没有活性的、难溶的包涵体形式存在，除此之外，蛋白质还在翻译后没有相应的机制对其进行修饰和加工。蛋白质被分泌后会被翻译以及加工，实现糖基化并形成二硫键[1]。

黑曲霉适于表达同源蛋白，但对外源蛋白，分泌效率及产率明显降低，下降幅度高达2-3个数量级。因此，如果需要获得比较多的目的蛋白，就应当采取一系列的方法对野生的菌株进行有目的的改造。选取适当的途径来使得其在表达外源蛋白时也具有比较高的分泌量，使其产量和表达同源蛋白时基本一致。在对蛋白进行分泌的各种途径中，蛋白质的折叠能力非常重要，不管是对于同源蛋白还是异源蛋白，都是其进行分泌的能力的关键瓶颈。未折叠蛋白反应被激活，促进了蛋白质分泌。因此，未折叠蛋白的反应是优化黑曲霉中蛋白质分泌的主要目标之一。

2丝状真菌非折叠蛋白响应研究进展

丝状真菌由于其具有非常可观的蛋白酶表达量及其高效分解纤维素的能力而被广泛应用于工业生产中，然而，丝状真菌的应用还存在着非常多的瓶颈，蛋白质从真核细胞中分泌出来之后会发生折叠，进而形成三级结构，整个过程是需要在细胞的内质网中进行的，内质网被称为细胞内长生分泌蛋白的关键细胞器，对于分泌蛋白的形成来说具有极其重要的作用，分泌蛋白和膜蛋白在内质网腔内进行折叠并逐渐变得成熟，然后传递到膜内系统的其他分室，它们或者可以显示在细胞表面，或者在细胞外部进行释放。蛋白质被分泌之后，会在内质网腔内被以某种方式进行正确的翻译，然后被修饰完成之后被转移到细胞外部，在经过正确的翻译以及修饰之后，蛋白质会逐渐实现糖基化以及磷酸化，除此之外也有二硫键逐渐形成。内质网腔内富含蛋白质和伴侣进而影响蛋白质折叠，若折叠机制饱和或者错误，蛋白质开始积累，进而引起未折叠蛋白质响应等相关调节机制以缓解内质网腔内的压力。

3改变非折叠蛋白响应途径对表达异源蛋白的影响

根据研究，丝状真菌在表达异源蛋白时能够显著地诱导非折叠蛋白响应。通过修饰非折叠蛋白反应途径或特定组分可增加丝状真菌中蛋白质产量。异源蛋白的表达常常导致错误折叠的蛋白在内质网中积聚，引发内质网应激效应。在第一批被鉴定为内质网应激上调的基因为分子伴侣 Bip A、二硫键异构酶Pdi A和凝集素伴侣蛋白ClxA。通过单独过表达这些基因来增加异源蛋白质产量的尝试在少数情况下是成功的。表明待产生的蛋白质的特定特征，例如糖基化位点，疏水片或二硫键需要不同的内质网驻留蛋白质被上调。在由 DTT处理诱导的内质网应激期间，以及在黑曲霉中过表达人组织纤溶酶原激活物（t-PA），已经显示25种基因同样被上调。这些发现表明，根据内质网应激的质量和数量，调整非折叠蛋白响应计划以触发适当的反应并抵抗内质网压力。组成型活性hacA的表达似乎足以重新编程黑曲霉中内质网和分泌途径的下游组分。与该假设一致，在酵母酿酒酵母中已经获得了对非折叠蛋白响应组成型活化的异源蛋白质产生的积极作用。此外，当非折叠蛋白相应相关基因如 hacA，sstC，pdiA，gptA，ostA，eroA或 cnxA过表达和编码 ERAD组分的基因时，也觀察到黑曲霉中异源蛋白质的产生和分泌增加。

4结束语

目前黑曲霉作为宿主表达外源蛋白，尤其是非丝状真菌蛋白时，分泌表达量往往较低，已发现在分泌途径中，非折叠蛋白响应及其相关调控基因对外源蛋白的表达有一定作用。改变非折叠蛋白响应途径回对异源蛋白的表达产生一定影响。通过共表达非折叠蛋白反应相关基因能为黑曲霉中外源蛋白的优化表达提供有价值的参考。

参考文献

[1] 周庆欣.丝状真菌遗传转化体系的建立[D].山东：山东农业大学，2007.