耿化梅

(兰州石化职业技术学院，甘肃 兰州 730060)

铜元素是动植物体中所必需的微量元素之一，是继铁和锌之后人体内的第三大金属离子，在生命体中扮演着非常重要的角色，在有机体中扮演了非常重要的生理过程，它可以替代其它金属离子参加酶催化反应，Cu2+在体内的适量存在有益于维持机体的正常工作，但是，在人体内Cu2+的代谢平衡受到破坏就有可能导致一系列疾病，如缅克斯(Menkes)综合症和威尔森氏(Wilson)综合症等。铜离子在环境中的浓度虽然不高，但是广泛存在于环境当中，如果长期积累且不能有效地降解会引发毒性效应，所以被认为是可造成环境污染的重金属离子之一。因此，如何应用有效的方法快速灵敏地检测微量铜离子，对于生命科学、环境科学都有着重要的意义[1]。

近几十年来对有机荧光分子检测金属离子已有大量报道。检测铜离子的方法有比色法，电化学和荧光响应[2]。已知顺磁性Cu2+是一种高效的荧光碎灭剂，因此其荧光光谱检测方法多为荧光碎灭法[3]。2006年，Jia-Sheng Wu等[4]报道了在pH值1～14范围内都可运用的铜离子淬灭性荧光探针。2008年，MingMing Yu等[5]合成了对锌离子和铜离子具有颜色选择性的荧光开关，并且同时可作为锌离子荧光增强型，铜离子荧光淬灭型探针。2009年，Shu-Pao Wu等[6]制备了水溶性的铜离子荧光探针，铜离子的加入可使其荧光淬灭90%以上。

在本实验中，我们通过简单的有机反应设计合成了铜离子淬灭性荧光探针INDOLE，并对其进行了荧光灵敏度和选择性的测试。通过Benesi-Hildebrand方程分析，荧光探针INDOLE对铜离子的选择性是由于它们之间很强的络合能力K=3.34×105M。

1 实 验

1.1 试 剂

吲哚(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(化学纯)，天津市化学试剂二厂；三氯氧磷(化学纯)，天津光复化工研究厂；N,N-二甲基乙二胺(分析纯)，Alfa Aesar；无水乙醇(化学纯)，天津光复化工研究厂；硼氢化钠(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷(化学纯)，天津光复化工研究厂；乙酸乙酯(实验室重蒸)；石油醚(实验室重蒸)。

1.2 仪 器

Bruke Daltonics APEXⅡ47e质谱(HR-ESIMS)；Varian Mecuy-300BB超导核磁共振仪(内标TMS，溶剂CDCl3)；Perkin Elmer LS55荧光仪；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZKF040真空干燥箱，上海实验仪器厂有限公司；分析天平，赛多利斯(北京)科学仪器有限公司；烘箱，天津市津北真空仪器厂。

1.3 制备荧光探针INDOLE[7]

1.3.1 合成3-吲哚醛

在250 mL三口烧瓶中加入0.05 mol吲哚和0.025 mol N,N-二甲基甲酰胺，在冰浴条件下，缓慢滴加5 mL三氯氧磷。滴加完毕，在40 ℃反应2 h，直至反应液变为鲜黄色固体。

然后，加入30 g冰溶解固体得红色溶液，用NaOH溶液调节pH直中性，加热至130 ℃，冰箱中冷却过夜，过滤，干燥，得粉红色产品。

重结晶(溶剂无水乙醇)，热过滤，冷却结晶得桔黄色片状晶体。

(1)

1.3.2 合成荧光探针INDOLE

在100 mL单口烧瓶中，将5.1 mmol 3-吲哚醛无水乙醇溶液滴加入5.0 mmol N-(2-羟乙基)乙二胺无水乙醇溶液中，搅拌过夜，分批加入1.0 g硼氢化钠还原4 h，蒸去部分溶剂，加水分解硼氢化钠，分别用60 mL二氯甲烷萃取三次，无水硫酸钠干燥，蒸出二氯甲烷得黄色油状物。

柱层析分离产品，得黄色油状物。

(2)

2 结果与讨论

2.1 选择性

图1是INDOLE对Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cr2+，Al3+，K+，Na+，Fe3+，Cu2+的荧光选择性。由图1可知，向1×10-5mol/L INDOLE乙醇溶液中，加入1×10-5mol/L Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cr2+，Al3+，K+，Na+，Fe3+，Cu2+高氯酸盐，其中，只有Cu2+对INDOLE具有较强的荧光猝灭作用，而其它离子对其荧光也有作用但没有Cu2+对INDOLE作用强。因此，INDOLE对铜离子具有一定的荧光选择性。

图1 INDOLE乙醇溶液(1×10-5 mol/L)中加入不同金属离子 (1×10-5 mol/L Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cr2+，Al3+，K+，Na+， Fe3+，Cu2+)λex=285 nm, λem=350 nmFig.1 Ralative fluorescence intensity of sensor 1 (10 μM) in the presence of varions ions (10 μM). λex=285 nm, λem=350 nm

为了证明INDOLE是否能运用实际生活中，我们进一步测定了其它常见离子对铜离子的干扰试验。图2是Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cr2+，Al3+，K+，Na+，Fe3+对Cu2+的荧光干扰测试。由图2可知，当向INDOLE与其它离子的混合液中加入1当量的Cu2+可使INDOLE的荧光猝灭，因此，INDOLE对铜离子具有良好的荧光识别能力。

图2 在INDOLE与离子的乙醇溶液中加入铜离子 (1×10-5 mol/L)Fig.2 Ralative fluorescence intensity of sensor 1(10 μM) containing Cu2+ (1 equiv) and the background ions (1 equiv) λex=285 nm, λem=349 nm

2.2 灵敏度

灵敏度作为荧光化学传感器中的又一重要参数，由图3可知，随着铜离子浓度的增加，吲哚环中π-π*跃迁禁阻，电子云密度减弱[8]，荧光光谱由349 nm蓝移338 nm。我们知道，铜离子是含有空d轨道的顺磁性粒子，容易形成正四面体结构的配合物[9]，Cu2+离子和溶剂乙醇中的O原子，INDOLE分子中的两个N原子，一个O原子形成四配位数的配合物，但是，由于吲哚环中的氮原子没有与铜离子形成分子内氢键，荧光强度仅下降40%。

图3 加入不同浓度的铜离子INDOLE(1×10-5 M)的 荧光变化(λex=285 nm)Fig.3 Fluorescence intensity of sensor 1(10 μm) with increasing concentration of Cu2+(0 μM，0.04 μM, 0.18 μM，0.68 μM, 1.18 μM, 4.88 μM, 8.88 μM)in ethnol solution. λex=285 nm, λem=350 nm

2.3 Benesi-Hildebrand方程[10]

假设INDOLE(L)与Cu2+-配位比为的1:n型，则方程式如下：

平衡常数k为：

(1)

(2)

式(2)可转化为：

(3)

式(3)转化为荧光：

(4)

式中：Fmin是没有加离子时INDOLE的荧光强度；Fmax是加入过量的Cu2+时INDOLE的荧光强度；F是随着Cu2+浓度的增加INDOLE的荧光强度。合并式(3)和式(4)得：

(5)

式(5)可转化为：

(6)

当n=1，对1/F-Fmin和1/Cu2+作图，1/F-Fmin和1/Cu2+为一直线，表明荧光探针INDOLE与Cu2+形成1:1型配合物，络合常数K为斜率/截距3.34×105M。

图4 Benesi-Hildebrand 方程INDOLE 和Cu2+Fig.4 Benesi-Hilderbrand plot of sensor 1 with Cu2+

3 结 论

合成有机分子INDOLE，对其进行荧光测试。实验证明，铜离子对INDOLE具有荧光猝灭作用，并且当INDOLE中拥有其它离子Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cr2+，Al3+，K+，Na+，Fe3+时，这些离子并不干扰铜离子对INDOLE的荧光淬灭。铜离子之所以对INDOLE具有淬灭作用是因为Cu2+离子的半径刚好可以进入INDOLE分子的孔道中，Cu2+离子和溶剂乙醇中的O原子，INDOLE分子中的两个N原子，一个O原子形成四配位数的配合物，但是，由于吲哚环中的氮原子没有与铜离子形成分子内氢键，荧光强度仅下降40%。并且，Benesi-Hildebrand方程证明它们形成的是1:1型配合物。