欧阳金明 杨明华

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江省中药研究所 浙江 杭州 310016

笔者通过实验研究，分析丹栝方对糖尿病动脉粥样硬化大鼠糖脂代谢及活性氧（ROS）、胸主动脉核因子κB（NF-κB）及其mRNA表达的影响。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选择我院实验中心提供的80只雄性SPF级糖尿病GOTO-KAKIZAKI大鼠作为研究对象，糖尿病均为自发，均为13周龄，平均体质量346.98±25.13g；同时选择我院实验中心提供的20只雄性SPF级Wistar大鼠开展研究，均为13周龄，平均体质量362.85±12.37g。根据每笼5只将大鼠独立饲养在通气笼具系统中，设定温度21～23℃，湿度45.0%～55.0%，饲料配方：由实验中心提供普通饲料，高脂饲料由2.00%胆固醇、87.63%普通饲料、0.07%丙基硫氧嘧啶、10.00%精炼猪油和0.30%猪胆盐构成。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 药物：丹栝方属中药方剂，配伍严谨，方剂组成如下：丹参、白僵蚕9g，瓜蒌（栝蒌）12g，川芎、郁金、薤白各10g，赤芍6g。加水煎煮成1g/ml丹栝方药液（内含原生药1∶1）。辛伐他汀（杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20180007，20mg/片）配制为悬浊液，浓度0.25mg/ml。二甲双胍（山东力诺制药有限公司，国药准字H37023557，0.25g）准确配制为悬浊液，浓度18.75mg/ml。

1.2.2 造模：取80只GOTO-KAKIZAKI大鼠,2次快速血糖平均水平≥11.1mmol/L视作糖尿病成模大鼠。所有GOTO-KAKIZAKI大鼠给予高脂饲料喂饲，腹腔注射10mg/（kg•d）NOS抑制剂-L-NAME（N-硝基L-精氨酸甲酯），持续喂饲2周，介导动脉粥样硬化发生。6个月后，于显微镜下观察动脉形态。给予每只大鼠皮下注射2U/d诺和灵N，持续注射10d，结果显示大鼠的易激惹症状不断减轻。于第14d检测血糖水平约为10mmol/L，停止胰

1.2.3 分组和干预方法：根据体质量对GOTO-KAK‐IZAKI糖尿病成模大鼠进行分层，依据血糖水平，按随机数表法分成丹栝方组20只，应用8ml/（kg·d）丹栝方治疗；二甲双胍组20只，应用150mg/（kg·d）二甲双胍治疗；辛伐他汀组20只，应用2mg/（kg·d）辛伐他汀治疗；模型组20只，给予8ml/（kg·d）无菌水喂饲；同期选择20只同龄、同体质量Wistar大鼠纳入正常对照组，给予普通饲料喂饲。在预实验基础上干预管理6个月后，各组大鼠不禁水但禁食12h获取组织标本。

1.2.4 测定指标：对大鼠的毛发和精神状态、食量、活动状况、体质量等进行观察。6个月后，各组大鼠均接受12h禁食，经腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛。麻醉后于腹部正中线位置剖开，分离腹主动脉血管，抽取血液10ml后置于3000r/min离心处理10min，提取血清，放于-20℃冰箱内冻存，待测。另抽取1ml血液，置于10%EDTA二钠中混匀，经 3000r/min离心处理后提取血清，放于-20℃冰箱内冻存，备用。采集大鼠胸椎动脉弓组织置于4%多聚甲醛固定，实施HE染色；后将部分胸主动脉置入RNA液内进行保存，备用，检测其mRNA。

1.2.5 检测基础指标：经全自动生化仪对大鼠的空腹血糖（FBG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）等指标进行监测，并经特定蛋白分析仪检测糖基化血红蛋白（HbA1c）表达水平；同时，经双抗夹心酶联免疫吸附法测定ROS表达，严格按试剂盒要求开展实验操作，试剂盒每列设定8孔，并每组设8个标本。

1.2.6 免疫组化法检测胸主动脉NF-κB阳性表达率：经免疫组化法测定胸主动脉NF-κB表达，严格按试剂盒要求实施操作，于显微镜下对细胞内阳性表达进行观察，若分布棕黄色颗粒代表阳性细胞表达。

1.2.7 RT-PCR测定主动脉NF-κB mRNA阳性表达：经RT-PCR法测定主动脉NF-κB mRNA表达，包括提取总RNA、逆转录制备cDNA、设计/合成引物、RT-PCR扩增cDNA，所有操作均严格按说明书要求实施。经Rotor-Gene 6.0软件依据反应的荧光对数据、标准品浓度进行实时监控，对CT值进行计算。

1.3 统计学处理：应用SPSS 23.0研究统计学数据进行处理，计量资料用±s表示，组间比较用t检验；计数资料用n（%）表示，组间比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基础情况：各组大鼠接受干预前状态表现良好，活泼好动且被毛光泽，但产生易激惹征象。实验期间，辛伐他汀组、二甲双胍组和模型组的大鼠分别死亡2只、4只、4只；丹栝方组和正常对照组大鼠未死亡。干预前各组大鼠的体质量对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；但干预完成时模型组、丹栝方组、二甲双胍组、辛伐他汀组GOTO-KAKIZAKI大鼠的体质量均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；相较于干预前，干预后模型组和丹栝方组大鼠的体质量增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常Wistar大鼠的体质量随着观察时间延长而显著增高。见表1。

2.2 各组FBG和HbA1c：干预后模型组大鼠的FBG、HbA1c水平均高于正常对照组、丹栝方组、辛伐他汀组、二甲双胍组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 干预前后各组大鼠的体质量对比（±s，g）

表1 干预前后各组大鼠的体质量对比（±s，g）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与干预前比较，bP＜0.05。

干预后518.65±19.41b 374.53±23.55ab 368.24±30.97ab 357.62±30.89a 347.76±25.13a组别正常对照组模型组丹栝方组辛伐他汀组二甲双胍组例数20 16 20 18 16干预前362.27±11.64 359.82±29.76 357.29±23.43 358.36±24.32 356.84±25.19

表2 干预后各组大鼠的FBG和HbA1c水平比较（±s）

表2 干预后各组大鼠的FBG和HbA1c水平比较（±s）

注：与模型组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组模型组丹栝方组辛伐他汀组二甲双胍组HbA1c（%）5.52±0.26#9.23±1.07 7.38±0.91#8.40±0.79#7.74±1.03#例数20 16 20 18 16 FBG（mmol/L）3.04±0.47#10.78±0.73 6.25±1.11#7.49±1.85#6.37±0.69#

2.3 各组血脂指标和ROS水平：模型组大鼠LDL-C及TC、HDL-C水平均高于正常对照组；模型组大鼠LDL-C和TC、TG、ROS水平均高于丹栝方组、辛伐他汀组、二甲双胍组；丹栝方组大鼠LDL-C和TC、TG水平均低于二甲双胍组；丹栝方组大鼠HDL-C水平高于辛伐他汀组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠干预24周后血脂指标、ROS表达水平对比（±s，mmol/L）

表3 各组大鼠干预24周后血脂指标、ROS表达水平对比（±s，mmol/L）

注：与模型组比较，#P＜0.05；与丹栝方组比较，eP＜0.05；与辛伐他汀组比较，fP＜0.05。

ROS 22.29±2.34 22.18±1.97 18.86±3.20#17.54±3.31#16.98±1.95#组别正常对照组模型组丹栝方组辛伐他汀组二甲双胍组例数20 16 20 18 16 LDL-C 0.58±0.33#13.84±1.17 7.26±1.12#8.15±2.01#9.13±0.94#e TC 2.39±0.24#16.38±1.15 9.87±0.83#10.54±2.03#11.68±0.95#e HDL-C 0.75±0.16#2.11±0.18 2.41±0.13f 1.75±0.24 2.06±0.25 TG 1.99±0.52 1.73±0.16 0.79±0.22#1.27±0.25#1.02±0.37#e

表4 各组大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA阳性表达率（±s，%）

表4 各组大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA阳性表达率（±s，%）

注：与模型组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，*P＜0.05。

NF-κB mRNA 20.17±3.28#43.94±0.52 32.18±0.23#*16.34±0.05#*36.85±0.31#组别正常对照组模型组丹栝方组辛伐他汀组二甲双胍组例数20 16 20 18 16 NF-κB阳性表达1.49±0.31#10.82±0.83 6.20±0.86#6.73±0.79#6.92±0.73#

2.4 各组NF-κB、NF-κB mRNA阳性表达率：模型组大鼠NF-κB阳性表达率、NF-κB mRNA阳性表达率均高于正常对照组、丹栝方组、辛伐他汀组、二甲双胍组，差异有统计学意义（P＜0.05）；丹栝方组、辛伐他汀组大鼠的NF-κB mRNA阳性表达率均低于二甲双胍组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 各组免疫组化法结果：于显微镜下观察NF-κB阳性表达多处于中膜平滑细胞、内膜内皮细胞相关细胞核内，能发现褐色染色颗粒。正常组大鼠血管内膜偶见阳性表达；模型组呈强阳性表达，能见密集分布的褐色染色颗粒；而辛伐他汀组为阳性表达，内膜能发现分布较多褐色染色颗粒；但较弱于模型组；同时，丹栝方组、二甲双胍组为弱阳性表达，能见散在分布的褐色染色颗粒。微量核酸-蛋白定量仪定量提取各组大鼠胸主动脉的总RNA发现，OC260/OC280值全部处于1.8～2.0范围。

3 讨论

近年来，随着临床深入研究氧化应激发现，促进患者血糖和血脂水平恢复正常，或是将氧化应激产生阻断，将氧化应激产物消除，能有效降低氧化应激；但因氧化应激、肥胖、增龄、不良环境、吸烟和缺乏运动等相关因素影响，难以彻底消除氧化应激[1]。ACCORC（划时代控制糖尿病心血管风险行动）研究结果显示，开展严格的及强化的降压和降糖、降脂干预，能有效减轻糖尿病大血管病变，预防或缓解糖尿病微血管病变[2]。研究数据发现，中医药的多靶点作用存在多效性特点，如丹栝方具有适度的氧化应激调控能力，能够在降低患者糖代谢指标、改善患者血液黏度的基础上，在预防心血管并发症风险中亦能起到良好的作用[3]。研究结果表明，体内氧化应激因子是造成糖尿病患者并发动脉粥样硬化综合征的主要指标机制和影响因素；而血液中的高脂、高糖通过刺激代谢系统，分泌氧化应激因子，进而对糖尿病患者的血管内皮细胞造成永久性损伤[4]。相关研究指出，氧化应激为心血管疾病、胰岛素抵抗及糖尿病等相关病变发生的基础，故认为对氧化应激进行干预，能有效防治糖尿病和其血管并发症[5]。

中医学认为，糖尿病是一种气血津液疾病，机体痰浊易生和代谢失调为糖尿病发生重要原因，长时间可导致痰瘀互结及脉络失养。丹栝方作为中药制剂，将方内丹参和栝蒌作为君药，具有化痰活血的作用；其中丹参性寒能入营血，而栝蒌性寒、润，两者合用发挥活血化瘀、清热祛邪、养护营阴等功效，达到标本兼治作用；方内川芎、赤芍、白僵蚕及郁金作为臣药，能增强活血化瘀及祛邪作用；薤白等佐药理气散结、宽胸通阳。诸药合用，能强化痰瘀同治及清润通络功效。相关研究显示，赤芍多糖和川芎多糖均能清除自由基和超氧阴离子；丹参能抵抗大鼠动脉粥样硬化，增加超氧化物歧化酶表达，减少丙二醛表达[6-7]。

研究结果发现，糖尿病患者体内高指标葡萄糖会通过人体代谢系统分解生成丙酮酸，而丙酮酸一旦通过三羧酸循环为线粒体呼吸链提供过多供氢体，会大幅增加体内生成活性氧[8]。活性氧作为人体主要细胞中的转导因子，抑制三磷酸甘油醛脱氢酶活性，诱发心血管并发症。药理学研究显示，丹栝方能使高糖培养的内皮细胞中ROS表达显著降低[9]。本研究结果显示，丹栝方能明显减少高糖高脂动脉硬化模型大鼠循环血液内活性氧表达水平。丹栝方能发挥调脂和调糖作用，对高糖和高脂释放的ROS进行抑制，并能对NF-κB的阳性表达、NF-κB mRNA表达进行调控，阻断氧化应激引起的炎症反应[10]。本研究表明，模型组大鼠NF-kB阳性表达率、NF-κB mRNA阳性表达率均高于正常对照组、丹栝方组、辛伐他汀组、二甲双胍组；丹栝方组、辛伐他汀组大鼠的NF-κB mRNA阳性表达率均低于二甲双胍组；提示丹栝方能有效调节糖脂代谢，减轻氧化应激，预防糖尿病动脉粥样硬化。

综上所述，丹栝方可调节糖尿病动脉粥样硬化大鼠的血糖和血脂，减轻氧化应激，改善糖尿病动脉粥样硬化情况。但因糖尿病和动脉粥样硬化的连接环节较为复杂，涉及抗炎、内皮细胞保护、细胞趋化、抗增殖和细胞黏附等情况，后期需开展深入研究。