杨龙艳 王 岩 许月超 程雅楠 马 燕 赵 冬

(首都医科大学附属北京潞河医院内分泌代谢与免疫性疾病中心 糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京 101149)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损伤因素所致的肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。随病程的进展而表现为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化[1]。近年来NAFLD的发病率呈明显的上升趋势，一项Meta分析结果[2]显示，全球NAFLD的发病率为25%，其中高达59%会进展为脂肪性肝炎。NAFLD可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌，还可参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病，严重危害人类健康[3]。目前对于NAFLD的诊断金标准是有创的肝组织活检，对于无创的评估方法包括超声、核磁共振等，都存在一定局限性。所以探索NAFLD的血清学标志物至关重要。血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)在肝脏、脂肪、巨噬细胞中合成，分泌入血后，抑制脂蛋白脂酶活性，参与脂代谢的调节[4]。本研究采用临床病例对照研究，探讨ANGPTL4与NAFLD及严重程度的关系，分析ANGPTL4作为NAFLD潜在的血清分子标志物的可能性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至12月在首都医科大学附属北京潞河医院内分泌代谢与免疫性疾病中心诊断为NAFLD的52例患者为病例组(NAFLD组)，同期选取47例健康者为对照组。所有研究对象都由同一名超声科医生进行腹部超声检查，并将NAFLD患者分为轻度、中度和重度。纳入标准为：年龄30～50岁；不过量饮酒(男性：饮酒量<30 g/d，女性：饮酒量<20 g/d)。排除标准：糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)、脑血管病、慢性肝病、服用降脂药或其他药物的患者。

1.2 研究方法

(1)临床检测：测量身高、体质量并计算体质量指数(body mass index, BMI)。检查前，受试者从22∶00禁食，并在第二天早上7∶00～8∶00抽取静脉血样本。血液分析包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase,AST)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)、三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)。低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。血清样本分装并储存在-80 ℃冰箱。

(2)ANGPTL4检测：采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测血清ANGPTL4浓度，人血清ANGPTL4的ELISA试剂盒购于日本Immuno-Biological Laboratories公司。

(3)NAFLD诊断：所有受试者都接受了腹部超声检查，由同一名超声医生进行操作和实施。超声检查均采用HITACHI Preirus彩超诊断仪(日本日立公司)，探头频率1-5 MHz，观察肝脏大小、形态、包膜、肝实质回声、肝内血管结构等。NAFLD超声诊断分级标准：①轻度：肝实质回声弥漫性改变，稍细密、增强；后方回声无衰减，包膜清晰；肝脏内管状结构清晰可见。②中度：肝实质回声弥漫性改变，细密、增强；后方回声有衰减，包膜欠清晰；肝脏内管状结构欠清晰。③重度：肝实质回声弥漫性改变，显著细密、增强；后方回声衰减明显，包膜不清或者不可见；肝脏内管状结构不清或者不可见。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 2组基本特征比较

NAFLD组的年龄、BMI、收缩压、舒张压、ALT、AST和TC与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。2组GGT、TG、HDL-C和LDL-C指标比较，差异无统计学意义(p>0.05)，详见表1。

2.2 各组间血清ANGPTL4浓度比较

为了分析ANGPTL4在NAFLD进展中的作用，将52例NAFLD患者分为轻度NAFLD(28例)和中重度NAFLD (24例)。结果显示，随着NAFLD严重程度的升高，血清ANGPTL4浓度逐渐升高(F=4.553，P=0.0354)。提示ANGPTL4与NAFLD的发生和进展有关，详见表2。

2.3 ANGPTL4用于NAFLD评价的效果分析

ANGPTL4的ROC曲线下面积为0.638(95%CI：0.526～0.750)，表明ANGPTL4有一定识别NAFLD的能力。最大约登指数对应的ANGPTL4浓度为90.93 ng/mL，以此作为诊断NAFLD的临界值。诊断结果与超声诊断结果的比较详见表3。虽然诊断的灵敏度为100%，但特异度较低，一致性中等，可用于临床的辅助诊断，但应注意误诊率。

表1 NAFLD组与对照组基本特征比较

ItemNon-NAFLD(n=47)NAFLD(n=52)tPAge/a42.83±4.6637.52±4.485.700.000BMI/(kg·m-2)23.32±3.4027.69±3.33-8.000.000Systolic blood pressure/mmHg△115.9±15.6126.4±14.4-3.280.001Diastolic blood pressure/mmHg△70.35±9.7279.84±11.11-4.360.000ALT/(U·L-1)20.17±13.3541.79±31.03-4.780.000AST/(U·L-1)18.00±4.9723.38±11.85-3.080.003GGT/(U·L-1)27.65±31.3438.87±24.76-1.870.066TC/(mmol·L-1)1.17±0.702.40±1.33-5.680.000TG/(mmol·L-1)4.89±0.974.88±0.99-0.150.883HDL-C/(mmol·L-1)1.48±0.321.37±0.511.200.235LDL-C/(mmol·L-1)2.94±0.772.80±0.960.600.550

△1 mmHg=0.133 kPa;NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;BMI: body mass index;ALT:alanine aminotransferase;AST:aspartatea aminotransferase;GGT:γ-glutamyltransferase;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;LDL-C: low density lipoprotein cholesterol;HDL-C: high density lipoprotein cholesterol.

表2 各组间血清ANGPTL4浓度比较

NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

表3 ANGPTL4用于NAFLD诊断的效果评价

Sensitivity=100%，Specificity=46.8%，Kappa=0.48;NAFLD:non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

3 讨论

NAFLD是常见的一种慢性肝脏疾病，患病率逐年上升，目前已成为除病毒性乙型肝炎以外的又一严重影响肝脏功能的重大肝脏疾病。NAFLD患者多数没有明显的临床症状和表现，多数因为体检而被发现。NAFLD早期进行干预或者治疗是能够逆转的。NAFLD早期没有及时发现并进行有效的干预治疗，就会进展为非酒精性脂肪性肝炎甚至是肝硬化、肝癌，所以NAFLD的早期诊断和治疗至关重要。目前肝活检仍是诊断NAFLD的金标准。然而，肝活检是一种侵入性的方法，而NAFLD发病率很高，用肝活检来筛查NAFLD显然是不可行的。各种血液标志物检测用于评估NAFLD的严重程度，目前纤维化试验，如BARD评分、NAFLD纤维化评分和Fibrosis-4指数，对晚期纤维化的诊断是有用，而不适于轻度NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalco-hoic steatohepatitis, NASH)[5-8]。虽然在某些临床情况下，NAFLD患者会出现血清ALT和AST的升高，但是这些肝酶指标并不能特异性识别NAFLD并反映其严重程度。其他血清生物标志物如细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)、CXC趋化因子配体10[chemokine (C-X-C motif) ligand 10, CXCL10]、人纤溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)、脂肪因子和成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)被认为可能作为NAFLD严重程度的非侵入性指标，但都尚未被证明是临床有效[9]。所以本研究探索NAFLD的血清学新的诊断标志物，为NAFLD的早期诊断和区分严重程度提供新思路。

ANGPTL4属于类血管生成素样蛋白家族成员，分泌入血后，它被分解为N-末端片段(含有抑制脂蛋白酯酶活性区，可形成低聚物)和C-末端片段(含有纤维蛋白原样结构，保持单聚体状态)[10]。ANGPTL4通过抑制脂蛋白脂肪酶二聚体形成，而抑制脂蛋白脂肪酶的活性[11]。过表达ANGPTL4小鼠表现为高三酰甘油血症；相反，在ANGPTL4敲除的小鼠，其三酰甘油下降65%～90%，极低密度脂蛋白胆固醇浓度下降，且伴有脂蛋白酯酶活性升高[12]。ANGPTL4在脂质代谢中起到重要的作用。然而，血清ANGPTL4浓度与NAFLD之间的关系尚不清楚。

本研究结果提示，与非NAFLD对照相比，NAFLD患者血清ANGPTL4浓度明显升高，并随着NAFLD分级而升高(F=4.553，P=0.0354)。ANGPTL4的ROC曲线下面积为0.638，表明ANGPTL4有一定识别NAFLD的能力。血清ANGPTL4诊断结果与超声诊断结果比较，灵敏度=100%，特异度=46.8%，Kappa=0.48。以上研究结果提示ANGPTL4在NAFLD的发生和进展中起到重要作用，并对NAFLD的诊断具有一定的预测作用。以往动物实验中研究[13]显示腺病毒介导的ANGPTL4过表达可降低血糖并诱发C57小鼠的高脂血症、肝肿大和脂肪肝。ANGPTL4增加了脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A脱水解酶等几种关键产脂酶的表达，使底物从糖异生转为脂肪生成，进而导致血糖浓度降低和肝脏TG含量增加[13]。鉴于ANGPTL4对糖代谢也有调控作用，所以本研究排除了糖尿病患者，单纯研究ANGPTL4对NAFLD的作用。2019年5月的最新研究[14]显示：地塞米松处理野生型小鼠显著增加血浆三酰甘油浓度，而地塞米松处理ANGPTL4敲除小鼠，血浆三酰甘油浓度无明显变化。说明ANGPTL4作为糖皮质激素的靶基因，是长期或者过量糖皮质激素暴露导致脂质紊乱包括高三酰甘油血症和脂肪肝所必需的。以上动物研究结果和本研究的结论一致，ANGPTL4在NAFLD的发生发展中起到重要的作用。

综上所述，NAFLD的早期诊断和及时干预治疗可以逆转早期NAFLD。所以探索NAFLD血清预测因子具有非常重要的意义，本研究显示，与对照组相比，NAFLD患者血清ANGPTL4浓度升高，并随着NAFLD的严重程度而逐渐升高。ANGPTL4对NAFLD患者具有一定的预测诊断能力。所以血清ANGPTL4浓度可能成为NAFLD以及严重程度的一个新的血清学预测指标。