卢 晶 李 奇 朱晓蓉 谢荣荣 杨金奎

(首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科 糖尿病防治研究北京市重点实验室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

现代社会，随着经济水平的提高和生活习惯的改变，饮食结构与以往存在很大差异，全球糖尿病发病率呈逐年上升的趋势。目前，我国糖尿病发病率居世界首位[1]。

胰腺由外分泌腺和内分泌腺两部分组成。胰腺内分泌腺又称胰岛。胰岛主要包括α、β、δ和PP细胞4种细胞。胰岛细胞可以分泌特异性的胰腺激素从而调节机体的血糖浓度。胰岛细胞数量减少，胰岛正常结构破坏，会导致机体糖耐量异常乃至糖尿病。传统途径中，ATP敏感性钾通道[ATP-sensitive K+(KATP) channel]主要调节胰岛β细胞在葡萄糖刺激下的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)。而电压门控依赖性ERG钾通道[voltage-gated eag-related gene (Erg) K+channels]家族也在胰岛细胞中高表达。ERG家族属于电压依赖性钾通道[voltage dependent K+(Kv) channels]，包括KCNH2编码的ERG1通道，KCNH6基因编码的ERG2通道以及KCNH7编码的ERG3。KCNH2突变的患者患有2型长QT间期综合征(long-QT syndrome)且胰岛素分泌浓度升高[2]。

糖尿病多重病理生理过程被描述为“恶兆八重奏” (ominous octet)[3]:①胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷;②肌肉组织葡萄糖摄取减少;③肝糖输出增加;④“肠促胰岛素效应”减弱;⑤胰高血糖素浓度升高;⑥肾脏对葡萄糖的处理失调;⑦神经递质功能紊乱;⑧脂代谢紊乱。脂代谢紊乱主要表现为总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)的升高，常伴有高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)的降低。糖尿病合并脂代谢紊乱贯穿于糖尿病胰岛素抵抗、血糖调节异常及糖尿病发生、发展的始末。糖尿病患者存在的糖脂代谢异常是引起血管神经组织病变，进而导致大血管及微血管合并症的重要原因，也是糖尿病致死率增高的主要原因[4]。

本课题组[5]的前期工作中，发现1个KCNH6钾通道杂合突变的糖尿病家系，家系中成年患者表现为低胰岛素血症和糖尿病，且KCNH6在葡萄糖刺激的胰岛素分泌中发挥重要作用，课题组前期采用TALEN技术成功构建了KCNH6基因全身性敲除小鼠动物模型，发现敲除小鼠存在糖耐量异常。进一步研究发现，6基因敲除小鼠存在血脂代谢异常，其作用机制与AMPK参与的脂肪酸氧化有关。上述研究都是在KCNH6基因全身性敲除的基础上完成。为了更精确的研究KCNH6基因对肝脏脂代谢的影响，本研究将采用Cas9技术构建KCNH6基因条件性敲除(conditional knockout，CKO)动物模型，并将其与肝脏特异性Cre小鼠(Alb-cre)杂交，最终得到KCNH6肝脏特异性敲除小鼠，探讨KCNH6基因对肝脏血脂代谢的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康的雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，购于南京大学，实验动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。实验时，雄性KCNH6敲除小鼠(KCNH6 knockout，KCNH6 KO)与野生对照小鼠(wild-type，WT)均为20周龄。饲养在环境温度为20～24 ℃、环境湿度为50%～70%的SPF级动物房内，正常日光周期，自由进食及饮水，保持垫料干燥。

1.2 采用Cas9技术构建条件性敲除小鼠

在小鼠KCNH6基因的非编码区中选择内含子2、3间和内含子4、5之间分别设计Cas9插入同向的LoxP序列，并在LoxP序列两端携带相应的同源序列，构建出两段“同源序列-LoxP-同源序列”的DNA片段作为打靶载体，设计策略见图1。5′端Cas9序列为5′-TAGGTAAAGCTGCTGTCCAAGCGGG-3′；3′端Cas9序列为5′-TGTCTCTAGCTGCTAACTTTGG-3′。

图1 Cas9设计策略Fig.1 Design strategy of Cas9UTR: untranslated regions

1.3 KCNH6基因条件性敲除小鼠构建

将纯化后的打靶载体通过显微注射的方法注入小鼠胚胎干细胞中，得到携带LoxP突变基因的靶细胞。将中靶细胞注入小鼠囊胚中内，将囊胚植入假孕小鼠子宫，发育得到F0代LoxP突变基因的嵌合体小鼠。

将嵌合体小鼠与野生型C57/B6小鼠进行繁育，得到F1代小鼠。通过基因型鉴定筛选出F1代杂合子，并用其作为亲本。交配繁育F2代，得到的F2代再进行基因鉴定，最终得到两条染色体均带有LoxP突变基因的纯合突变小鼠(Flox小鼠)，从而建立突变群体。

下列反应物构成20 μL的反应体系：模板DNA 2.0 μL，缓冲液 (含Mg2+) 2.0 μL，dNTP混合物(10 mmol/L) 0.5 μL，引物混合液 (10 mol/L) 0.5 μL， DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，超纯水14.5 μL。进行降落PCR，反应条件：预变性95 ℃5 min。变性98 ℃30 s；退火65 ℃30 s；延伸72 ℃ 45 s；共20个循环；再变性98 ℃30 s；退火55 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s；共20个循环。最后再延伸70 ℃10 min。PCR之后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。鉴定正向引物：5′-CCCCATCTGCTAAGCCTTAATTAC-3′；反向引物:5′-GAAGGCTGGAGGCTGCAAACC-3′。

1.4 KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠基因型的鉴定

由于Flox鼠的目的基因片段上下游均插入了同向的LoxP片段，将其与CreT小鼠进行杂交后，即能在特异性表达Cre重组酶的组织中将两段LoxP序列之间的基因删除，同时生成一个终止子，以达到条件性敲除目的基因的作用。剪取小鼠尾尖消化后，使用酚/氯仿法抽提基因组DNA，随后进行PCR扩增反应鉴定小鼠基因型。

构建PCR反应体系。PCR反应条件：预变性95 ℃5 min；变性95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃30 s；共40个循环，最后再延伸70 ℃10 min。PCR之后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。根据电泳结果筛选含有目的条带的小鼠，判断对应小鼠是杂合子还是纯合子,引物序列见表1。

1.5 一般情况和血脂测定

小鼠自离乳后开始监测体质量和进食量。10周和20周禁食12 h后内眦取血，监测体质量、进食量和血液生物化学相关指标。

1.6 统计学方法

应用Prism5 (GraphPad Software) 进行统计分析。两组间均数比较采用独立样本的Mann-WhitneyU检验。体质量监测采用双因素重复测量的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

F:forward;R:reverse.

2 结果

2.1 KCNH6条件性敲除小鼠鉴定

将F0代Flox小鼠与野生型C57/B6小鼠进行繁育，得到F1代小鼠。剪尾提取基因组后，采用降落PCR扩增的方法检测Flox片段。理论上，不含Flox片段的小鼠可见1条307 bp条带，Flox纯合子只有1条400 bp条带，杂合子有307 bp和400 bp 2条带。63和69为野生型，64、65、66、67为Flox杂合子小鼠(图2)。

图2 KCNH6条件性敲除小鼠鉴定电泳图Fig.2 Electrophoretic pattern of KCNH6 conditioned knockout mice identification63-69: mouse; TRANS 2K: marker.TRANS 2K plus II marker (bp): 8 000，5 000，3 000，2 000，1 000，750，500，250，100； 500 bp is highlight; P: positive control; B6: C57/B6; N: negative control.

2.2 KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠鉴定

将Flox纯合子小鼠(基因型为KCNH6flox/wt)与CreT小鼠进行杂交，得到表达Cre重组酶的Flox杂合鼠(基因型为KCNH6flox/wtCreT)和不表达Cre的Flox杂合鼠(基因型为KCNH6flox/wtCreW)。采用KCNH6flox/wtCreT进行内交，可得到表达Cre的Flox纯合鼠，基因型为KCNH6flox/floxCreT；或不表达Cre的小鼠，基因型为KCNH6flox/floxCreW。

采用鼠尾消化后提取DNA，PCR扩增检测Flox和Cre的表达。表达Flox片段的小鼠可在400 bp见条带(图3A)，表达Crew重组酶的鼠在351 bp处可见条带(图3B)，表达CreT重组酶的鼠在390 bp处可见条带(图3C)。成功构建出KCNH6基因肝脏细胞敲除鼠(基因型为KCNH6flox/floxCreT)及其对照鼠(基因型为KCNH6flox/floxCreW)。280为KCNH6flox/floxCreT(以下简称为KO鼠)。278、279、281、282为KCNH6flox/floxCreW(以下简称为WT鼠)。

2.3 KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠一般情况监测

经过大量繁殖后，得到大量KO和WT小鼠。选取雄鼠和雌鼠，监测小鼠体质量，差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

图3 KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠鉴定图Fig.3 Electrophoretic pattern of KCNH6 hepatic knockout mice identificationA:left: Flox is 400 bp; right: LoxP is 514 bp; B:CreW is 351 bp;C:CreT is 390 bp; P: positive control; B6: C57/B6; N: negative control; DL2000: marker. DL2000 marker: 2 000，1 000，750，500，250，100 bp. 750 bp is highlight.

图4 体质量曲线监测Fig.4 Detection of body weightA:male, WT:n=6,KO: n=9; B:female, WT:n=7,KO: n=8;WT: wild-type; KO: knockout.

2.4 KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠脂代谢

选取雌鼠和雄鼠KO，同窝对照为WT小鼠。分别在8周和20周禁食后内眦取血，测血清中总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。8周的雄鼠血脂4项差异均无统计学意义(P>0.05)，KO雌鼠的总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇均有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05,图5)。20周时，KO雄鼠总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇均明显高于WT组(P<0.05，图6)。

图5 8周KO和WT小鼠血脂4项检测结果Fig.5 Results of lipid metabolism in mice of 8-week-old A: male, WT: n=6, KO: n=9; B: female, WT: n=7, KO: n=8;TC: total cholesterol;TG: triglycerides;HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol；WT: wild-type; KO: knockout.

图6 20周小鼠血脂4项检测结果 Fig.6 Results of lipid metabolism in mice of 20-week-old A:male, WT: n=6, KO: n=9,*P<0.05，**P<0.01; B:female, WT: n=7,KO: n=8; TC: total cholesterol;TG:triglycerides;HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol；WT: wild-type; KO: knockout.

3 讨论

本研究采用Cas9技术构建了KCNH6条件性敲除小鼠，并将其与肝脏细胞特异性Cre (Alb-cre) 小鼠杂交，最终得到KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠。以同窝对照为阴性对照，监测两组小鼠的一般状况发现其体质量和进食量差异均无统计学意义(P>0.05)。成年雄性小鼠的胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白较对照组均有明显升高，提示模型小鼠存在肝脏血脂代谢异常。

经典的基因敲除有时候会因为某些基因对胚胎发育有影响而无法正常分娩，或者不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。而条件性基因敲除技术可以在特定的组织内敲除某个基因，从而避免这一问题，并且有更高的特异性，更有助于研究基因在特异性组织的作用。目前应用最为广泛的是基于Cre/LoxP系统构建条件性基因敲除小鼠[6]。Cre重组酶由大肠杆菌F1噬菌体中Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的蛋白质，它可以特异性识别DNA上的LoxP序列，后续介导不同的特异性重组反应[7]。传统的条件性基因敲除技术，采用ES细胞技术先构建条件性敲除小鼠，该技术稳定性高、特异性好，但实验步骤繁琐、周期较长等。Le等[8]利用RNA引导Cas9核酸酶技术可以在多种细胞中特定的基因组位点进行切割、修饰，这一技术随即被运用到构建基因敲除动物模型中。Cas9技术具有靶向精确性高，实验周期短，成本低和无物种限制等优点，在动物模型构建的应用前景十分广阔。本研究采用Cas9技术构建了KCNH6基因条件性敲除小鼠，用时仅半年。后期与肝脏细胞特异性Cre小鼠杂交1年后，得到大量KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠。

肝脏组织、脂肪组织和肌肉组织是参与机体能量代谢的重要组织器官。其中，肝脏作为机体的主要代谢器官，是体内碳水化合物和脂质生物合成的主要场所，在调节机体的糖脂调节中起着重要的作用。机体中糖代谢与脂代谢有密不可分的关系，一定条件下可以相互转化。非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)、高三酰甘油血症、血脂增高等脂代谢紊乱症状在代谢综合征、肥胖和2型糖尿病患者中普遍存在。在胰岛素抵抗时，肝脏糖代谢发生紊乱，后者又加重胰岛素抵抗；细胞中的脂肪酸大量堆积可以导致胰岛素抵抗，进而引发糖耐量异常，形成恶性循环。NAFLD可发展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和进行性肝纤维化，最终导致肝硬化和肝癌[9]。过量的脂质不仅在肝脏内积聚，还会在胰腺外周积聚，导致非酒精性脂肪性胰腺疾病(non-alcoholic fatty pancreas disease，NAFPD)。研究[10-11]显示，NAFPD促进胰岛素抵抗和糖尿病。长期增加循环血液中的游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)可导致细胞脂质毒性，并导致细胞功能障碍，增加基础胰岛素释放和葡萄糖刺激的胰岛素分泌紊乱。目前对于KCNH6在肝脏中的作用及其具体作用机制尚不清楚。本研究成果构建了KCNH6肝脏细胞特异性敲除小鼠，并且发现成年雄鼠存在较明显的血脂代谢紊乱。模型小鼠的构建，将有助于明确KCNH6在肝脏血脂代谢中的具体作用机制。

建立在动物模型构建成功的基础上，本研究拟通过高脂诱导喂养雄性小鼠，看能否有更明显的脂代谢异常表型。进一步通过分子表达谱测序，蛋白印记和定量PCR等方法寻找相关信号通路，明确KCNH6在肝脏脂代谢中的作用及其相关机制。