谢依侨， 孟佩佩， 李 祎

（暨南大学环境学院，广州511443）

0 引 言

水处理生物学是给排水科学与工程专业一门重要的专业基础课，主要介绍水处理工程和环境水体水质净化过程中所涉及的生物学问题［1］，对学生的实践动手能力要求很高，不仅需要重视理论教学的深度和广度，同时也必须注重实验教学环节［2］。纵观各高校水处理生物学实验课的教学项目，基本都设置了“考察微生物生理生化特性”这一综合性实验，学生通过实验统计总大肠菌群数和细菌总数。因为总大肠菌群、细菌总数是自来水厂2 个重要的出水卫生学指标，所以熟练掌握这个实验对今后从事水务工作的同学来讲是必不可少的［3］。但是该实验几乎涉及到了微生物实验所有的基础操作技能，因此学生们必须先掌握显微镜的使用与微生物形态观察、微生物染色技术、培养基的制备与灭菌、微生物纯种分离和接种技术等基本实验操作技能。

如何在紧扣大纲的基础上，创新实验课程的组织形式、完善实验教学及评价机制，对整个教学活动的实际效果及教学目标的顺利完成起到非常重要的作用［4-5］。因此，设计了一个新型的实验——领略微生物之美，来代替原本枯燥无味的微生物验证实验。该实验不仅涵盖了上述所需掌握的微生物实验技能，而且增添了实验的趣味性，可激发学生的学习兴趣，全面提高学生的综合应用能力与创新性思维［6-8］。同时，借助互联网平台，鼓励学生拍摄记录下实验过程中遇到的问题或特殊实验现象，通过分享讨论，提高他们分析问题、解决问题的能力，老师也会拍摄下学生在实验过程中的错误操作，上传至平台以规范操作细节，而且每位同学在实验后需将总结报告分享至平台，再组织学生互评，强调学生的主体地位，充分提高学习的质量与效果［9-11］。

1 水处理生物学实验授课思路

根据课程的教学大纲，水处理生物学实验是由基础微生物实验和综合性实验（测定水样中的大肠菌群数和细菌总数）两部分组成，这两个部分看似独立，其实是密切关联的，只有掌握了基础微生物操作技能，才能顺利开展综合性实验，所以以一个创新实验涵盖所有的基础微生物实验，为后续实验的开展奠定基础。在第一次实验课上要对本学期所开设的实验项目进行梳理，让每个学生有规划地去进行学习，以达到事半功倍的效果。

2 微生物作画实验目的及原理

基础的微生物实验技能是水处理生物学课程的学习基础，合理安排这些实验项目的先后顺序以及选择合适的组织形式，对于系统学习起到重要的辅助作用［12］。利用“不同微生物颜色、形态各不相同”这一特点，以微生物做颜料、平板培养基做画板进行创新实验，在合适温度下培养一段时间，让微生物菌落在平板上长出各种各样的图案。从菌的筛选、纯菌液的获取、培养基的制备、绘图到培养，每个环节都需要学生亲自动手，尽力而为，充分锻炼他们的微生物实验操作技能。多个微生物小实验构成了这个创新实验，而每一个小实验的设置都有其目的，必须按照一定的顺序去进行，学生们通过这个实验，不仅领略到了微生物之美，还学会灵活地运用这些技能，更好地去完成后续的综合性实验，更重要的是能充分提高学生的创新及综合应用能力［13］。

3 微生物作画实验步骤

3.1 实验材料、仪器及实验流程

3.1.1 实验材料

两种混合菌液，1 号混合菌液含大肠杆菌及铜绿假单胞菌，2 号混合菌液含白酵母和红酵母；玻璃器皿包扎用材料（纱布、报纸、棉线、棉花、透气橡胶塞）；灭菌指示胶带；配制培养基的材料（牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、营养琼脂、氢氧化钠、葡萄糖、酵母粉、麦芽提取物、XRD琼脂培养基粉末、蒸馏水）；接种环、接种针、一次性接种环及接种针（不同规格）；酒精灯；香柏油；革兰氏染色液；无水乙醇。

3.1.2 实验仪器

各种玻璃仪器；鼓风干燥箱；高温高压蒸汽灭菌锅；培养箱；摇床；无菌操作台；显微镜。

3.1.3 实验流程

微生物作画实验的大致流程如图1 所示。

图1 微生物作画实验流程

3.2 查阅文献

在这个趣味实验中，获得纯培养的菌种并完成活化是获得染料的关键步骤，而这必须建立在合适的微生物培养条件之上（见表1）。在老师指导下，学生通过查阅文献确定大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白酵母及红酵母的培养条件，包括培养基的成分、pH 值、培养温度、培养时间，如果是液体培养基，还需考虑振摇的转速。同时也了解了每一种微生物菌落的颜色、哪几种微生物可以在同一个培养基上生长，学生们还通过文献了解到XRD琼脂培养基也适合大肠杆菌及铜绿假单胞菌的生长，且其颜色为鲜红色，不同于近无色的营养琼脂培养基，故决定将其作为候选画板之一，这些文献资料为后续的实验开展奠定理论基础。

表1 各微生物在液体及固体培养基的培养条件

3.3 实验步骤

（1）玻璃器皿的洗涤、包扎及灭菌。玻璃器皿的洗涤对于微生物实验而言，起着至关重要的作用。对于新购的玻璃器皿需要先用1 ～2 mol/L 的硝酸溶液浸泡24 h，再用清水洗净，以除去游离碱；而使用过的玻璃器皿，一般情况下只需用洗洁精水溶液洗刷，冲洗干净后，再用纯水淋洗数次，但是如果接触过菌液的话，必须在121 ℃条件下高温高压蒸汽灭菌后，方可按一般玻璃器皿清洗，这一点是极为重要的，一方面残留的菌液直接排入下水道会对环境造成极大污染，另一方面受污染的玻璃器皿极有可能会直接导致实验失败；与此同时，在微生物实验中，经常需要用到移液管、吸管、载玻片和盖玻片等不适合使用刷子进行清洗的玻璃器皿，这种情况下选择用铬酸洗液进行浸泡，再清水冲洗。但在本科教学中，这部分内容经常由实验指导老师代劳，以至于无法引起学生的重视。

玻璃器皿的包扎也是一个考验学生动手能力及细心程度的环节，包扎好的玻璃器皿的外层报纸上粘贴灭菌指示胶带，用于确认每个玻璃器皿是否都达到了湿热灭菌的要求，再在121 ℃下灭菌20 min即可。

在该创新实验中，第1 次授课内容就是学习玻璃器皿的洗涤、包扎及灭菌，准备好的器皿将用于后续整个实验，所以每个学生都要学会为自己的实验负责，同时养成良好的实验习惯。

（2）配制微生物纯种分离所需的平板培养基。按照表1 处方配制好两种琼脂培养基，在不同条件下进行高压蒸汽灭菌后，冷却至40 ～50 ℃（摸上去不烫手），迅速注入培养基至铺满底部，立刻合上皿盖，平皿静置于桌上，冷凝即成平板，室温放置过夜，使平板表面干燥无水膜。在这个步骤中，严格的无菌操作是极为重要的，如果玻璃器皿或者培养基被污染，过夜的培养基上通常会长杂菌，不可用于分离。确保平板表面的干燥，可有效改善分离效果。

（3）划线和涂布以获得单菌落。在进行分离前，学生需要将纯水经高温高压蒸汽灭菌得无菌水，再以此稀释菌液，稀释倍数通常要达到106方可确保菌落呈分散生长，之后可用平板稀释或平板划线法进行分离。平板稀释法是将菌液滴于平板中央，再用涂布器进行涂布。平板划线法是用接种环取菌，接种环与平板成30°，前缘部位接触平板，“之”字形划线（见图2）。接种好的平板室温放置1 h，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于37 ℃恒温箱培养24 h，在室温下培养2 ～3 d，使菌落性状表现较充分。

图2 平板划线分离示意图

相较于平板划线，涂布的方法看似更为简单，但很多同学在实验过程中，由于没有采取预实验估计菌液合适的用量，导致菌落密度过高，无法区分开，合适的用量为1 d稀释后的菌液（约为50 μL）。而平板划线法对学生的操作要求更高，从上一区域引出菌液时，必须先灼烧接种环，否则起不到稀释作用，但第4 步与第3 步之间可连贯进行，划线的力度要恰当，否则容易刮破。

（4）斜面接种及纯培养菌种的菌体形态观察。制备试管斜面培养基及接种：试管斜面培养基与平板培养基的配方相同，区别在于，斜面培养基是借助漏斗将培养基分装至试管后灭菌，然后趁热将试管斜放，斜面长度一般不要超过试管长度的1/2，放置过夜即可。通过平板稀释和平板划线可在两个培养基中分别得到5 种单菌落，按无菌操作法，分别将取了菌的接种环伸入试管，在培养基表面“之”字形划线后密塞，按表1条件进行培养，可获得纯培养菌种。

纯培养菌种的菌体形态观察：对纯培养的菌种进行革兰氏染色以及镜检，不仅可判断细菌的纯度，还可进一步辨别菌体属于革兰氏阳性或阴性菌，并观察其形态结构。在此基础上，更好地保证“颜料”作画的质量。一般来说，细菌的菌落比较光滑湿润，可用接种环挑起极少量菌落进行革兰氏染色，主要分4 个步骤，即取菌-涂片-染色（初染-媒染-脱色-复染）-镜检。在这个小实验中，有几个细节会直接影响实验结果，包括取菌的量不可过多，否则涂片后菌落会重叠，导致脱色效果变差，无法观察到真实菌体情况；初染和媒染时，用纯水冲洗后不要用酒精灯烘干，否则残留的染料容易附着在玻片上；镜检时必须依次使用低倍镜、高倍镜、油镜进行调焦，根据“物镜同焦”这一现象，理论上在使用了低倍镜后再使用高倍镜、油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时，仅用细调节器即可清晰聚焦，而且用油镜观察完样本后，不可随意切换回高倍镜和低倍镜，防止玻片上的镜油污染干镜的镜头。

（5）液体接种及纯菌活化。在确认了菌落的纯度之后，需要将其由斜面接种至灭菌的液体培养基，进行活化，以获得“颜料”。取菌的工具为接种环，必须先灼烧灭菌后，在试管玻璃内壁或空白培养基处冷却，待培养基不再被接种环融化时，即可用环蘸取少量菌，然后迅速将接种环移入液体培养基中，轻轻搅拌，封口，合适条件下进行培养。

（6）进行图案设计并作画、培养。学生根据自己的喜好，选择合适的平板和菌液进行作画，图案自行设计且颜色自由搭配，但由于少量的菌液在平板上划线时，很快就被吸收，学生无法追踪之前画过的痕迹，提出先在滤纸上用黑色水笔设计好图案，将其垫于培养皿下方，可透过培养基看到图案，再以一次性接种环或接种针进行作画［见图3（a）、（b）］。选择一次性的接种环或接种针［见图3（c）、（d）］主要是因为其材质为聚丙烯，相比于传统镍铬合金的接种环和接种针，不会那么尖锐，即使力度把握较差的学生也不会轻易划破培养基的表面。

4 微生物作画实验教学与评价机制

图3 图案设计及作画工具

为了建立更合理的教学与评价机制，借助互联网学习平台，鼓励学生拍摄记录下实验过程中遇到的问题或特殊的实验现象，课后上传至学习平台与同学一起讨论分析，锻炼学生发现问题、分析问题与解决问题的能力。授课老师与实验指导老师在实验课堂上，拍摄记录下学生在实验操作过程中存在的问题，上传至学习平台与全体学生分享，从而让所有学生能够更规范地进行实验操作。

该趣味实验是由6 个小实验构成的，每1 次实验结束后，同学们需要对其进行总结，并将实验报告上传至学习平台，组织学生进行互评，评价标准在于其价值性，凭借这份报告是否可以有效地规避实验的雷区，提高成功的概率，以及加深对理论的认识和理解。最后师生一起参与微生物作画成品的投票，主要从颜色、构图等方面综合考虑评选出排名前三的作品（见图4），分享他们成功画出精美图案的实验技巧。可见，先在滤纸上绘图并以此为基础进行作画是完全可行的，为后续的操作发挥良好的辅助作用，而且学生所呈现的画作也是极具创意的。

图4 微生物作画的优选作品展示

5 结 语

根据给排水科学与工程专业的培养方案和课程设置，水处理生物学一般开设在大学二年级第一学期，是学生进入高校以来开设较早的专业课，所以实验技能、实验思想、实验习惯的好坏会直接影响其他实验课程的开展甚至科研水平［14］。

在水处理生物学实验中，借助微生物作画的趣味实验，将以往枯燥的玻璃器皿包扎、培养基制备及灭菌、微生物接种及分离、显微镜使用等内容融汇贯通在一起，每一个小实验之间都有一定的必然联系，看似独立，实则相通，这样的教学模式不只是为了提高学生对实验的兴趣，更多的是让学生们带有目的性地去完成每个小实验，这对于他们切实掌握微生物操作技能有较大帮助。由于每一步骤的成败都会直接影响下一个环节，所以学生们对实验的关注度会显著提高，通过前期准备，促使他们查阅文献，学会将理论应用于实践（如微生物培养条件、培养基的筛选等），在实践中加深对理论的认识和理解。

每一个小实验完成后，学生们需要对其进行总结，但与一般的实验报告有所不同，要求只有一点，“若今后他们要再次运用到这些微生物操作知识时，这份总结可以帮助他们顺利地去完成实验”，这样一来，很多学生选择了图文结合的方式记录下每个细节，将可能影响结果的因素加以注解，这个过程中得到的不只是一幅微生物作品，更多的是学习心得，浓缩起来仿佛是微生物实验书的一个缩影，相信对于学生今后学习其他相关实验课程都会有指导意义。每一位同学都将自己的实验总结上传至学习平台，组织学生进行互评，让每一个学生都有机会充当小老师，从另一个角度思考去发现自己在实验中的不足，增强学生参与感，从而提高教学质量与效果。作品完成后，师生共同参与点评，评选出排名前三的作品，并进行奖励，比如赠予水处理生物学创新实验相关的书籍，激发他们的兴趣，鼓励学生们参与大学生创新实验比赛，进一步提升自我。

该趣味实验采用创新的教学与评价模式，在保证完成教学任务的前提下，激发学生学习的兴趣，提高学生在实验中的参与度，强调学生的主体地位，从学生的角度出发，更好地去帮助他们理解实验的现象及结果，并且学会从中进行总结概括，对于今后学习其他实验课程乃至科研工作奠定良好的基础［15-16］。