郑纪伟，教忠意，王保松，何旭东*

(1.江苏省林业科学研究院， 江苏 南京 211153； 2.江苏省农业种质资源保护与利用平台柳树资源圃， 江苏 南京 211153)

全世界柳树有500余种，2/3为灌木柳，集中分布在北半球温带地区。我国有柳树275个种，122个变种，33个变型，各地区均有分布[1]。在我国，柳树是重要的园林绿化、优质的速生用材和高效的生物修复树种；在欧洲和北美，灌木柳被广泛用于生物能源[2]。柳树为雌雄异株植物，种内种间均易杂交，且柳树是多倍体种群，倍性复杂，导致柳树品种的鉴定十分困难[3]。近年来，随着育种工作的不断发展，选育的柳树新品种日益增多。截止2019年，获得国家植物新品种保护权的柳树新品种已有41个(国家林业局植物新品种保护办公室，2020)，主要包括江苏省林业科学研究院选育的‘苏柳’系列和山东省林业科学研究院选育的‘鲁柳’系列等。因此，鉴于新品种权保护的需要，建立一种柳树高效、快速、准确和可靠的分子标记鉴定体系，不但有助于保护品种所有权，更有助于柳树新品种的商业发展。

SSR(simple sequence repeat)标记具有共显性、高度变异、通用性高、重复性好等优点[4]，被作为构建指纹图谱较为理想的分子标记[5]，且被国际植物保护联盟(UPOV)认定为植物新品种保护最广泛的标记体系[6]，国内也把DNA水平的鉴定作为品种质量监控的重要措施。传统SSR检测方法与荧光引物和毛细管电泳技术相结合的检测技术，具有准确、高效等优点。近年来，已成功应用于杨树(Populussp.)[7]、桂花(Osmanthusfragrans)[8]、刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)[9]、含笑(Micheliasp.)[10]和白蜡(Fraxinuschinensis)[11]等木本植物的品种指纹图谱构建和核心种质鉴定研究。柳树中，SSR标记多用于遗传多样性研究[12-15]，然品种亲缘关系分析和指纹图谱构建等方面较少[16-17]，而利用荧光SSR标记构建柳树指纹图谱更是未见报道。因此，本研究首次以此技术构建了9个柳树新品种的指纹图谱，希望为柳树新品种的分子鉴定和变异分析提供高效、准确、可靠的技术体系，并为其新品种授权和保护提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与DNA提取

试验材料为江苏省林业科学研究院2018年获得国家植物新品种权的9个柳树新品种(见表1)。于江苏省林业科学研究院柳树资源圃采集无病害幼嫩叶片，利用基因组提取试剂盒[天根生物生化科技(北京)有限公司，DP305]提取总DNA。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Nanodrop one检测样品的质量和浓度，-20 ℃保存备用。

1.2 引物筛选

从课题组前期研究中筛选11对多态性较高的EST-SSR标记(见表2)[18]，用于构建9个柳树新品种的指纹图谱。引物正向5′端用荧光基团标记，由上海凌恩生物科技有限公司合成。

表1 9个柳树新品种

表2 11对引物信息

PCR扩增体系和反应程序参照郑纪伟硕士毕业论文[19]。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.3 基因分型体系建立

基因分型采用25 μL反应体系(见表3)。DNAC(模板)用量为10—15 ng。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。最后72 ℃延伸5—8 min。10 μL变性反应体系，包括HiDi 9 μL和LIZ500混合物1 μL。98 ℃变性5 min，迅速置于冰上冷却后，置于ABI 3730测序仪上进行毛细管电泳检测。

表3 PCR反应体系

1.4 数据分析

利用MSA软件计算11个SSR位点的观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)；利用NTSYS-pc 2.1软件采用UPGMA 法对9个柳树新品种进行聚类[10]。

2 结果与分析

2.1 SSR多态性检测

以9个柳树的总DNA为模板检验11对EST-SSR标记的多态性情况。11对标记共扩增出等位片段56条，每个位点等位基因数3—8个不等，平均为5.1个。其中，引物SALeSSR0020扩增的等位基因数最多，为8个；引物SALeSSR0020和SALeSSR0961最少，为3个。11个SSR标记的观测杂合度(Ho)变化范围为0.333 3到1.000 0，平均为0.687 5；期望杂合度(He)变化范围为0.477 1到0.882 4，平均为0.626 3。多态信息含量(PIC)变化范围为0.421 2到0.813 4，平均为0.605 9。引物SALeSSR0920的PIC最高，为0.813 4，引物SALeSSR0246最低，为0.421 2(见表4)。SALeSSR0733标记在部分柳树品种中的基因分型结果(见图1)。

表4 11对SSR标记在9个柳树新品种中的多态性检测

2.2 指纹图谱构建

通过对每个位点等位片段进一步分析，从11对SSR引物中挑选出3对核心引物用于构建9个柳树品种的指纹图谱(见表5)。引物SALeSSR0733可区分7个柳树品种，引物SALeSSR0086和SALeSSR0920均可区分6个柳树品种；引物SALeSSR0086与引物SALeSSR0733和SALeSSR0920中任意1个结合均可完全区分9个柳树品种。因此，利用这3对核心引物不仅可以区分柳树9个品种，且可以利用引物间的不同组合进行相互验证。

注：横坐标代表等位基因的长度(bp)；纵坐标代表荧光强度(RFU)图1 SALeSSR0733标记在部分柳树品种中的基因分型

表5 9个柳树新品种的指纹图谱

2.3 聚类分析

将11对引物扩增出的条带作为原始矩阵，利用NTSYS-pc软件计算9个柳树品种的遗传相似系数，遗传相似系数在0.605 9和0.910 7之间。在相似系数为0.636 4时，9个柳树品种可分为3个类群。第Ⅰ类群包括苏柳1701、苏柳1702、苏柳1704、苏柳1703和苏柳1705在内的5个品种，5个品种又分为2个亚类群，第1个亚类群包括苏柳1701、苏柳1702、苏柳1704，苏柳1701和苏柳1702遗传相似系数最大，为0.910 7，说明2个品种亲缘关系非常近；第2个亚类群包含苏柳1703和苏柳1705。第Ⅱ类群包含苏柳‘迎春’和苏柳‘紫嫣’。第Ⅲ类群包括苏柳‘喜洋洋’和苏柳‘瑞雪’，与其他 7个品种之间亲缘关系最远(见图2)。

图2 9个柳树新品种亲缘关系聚类图

3 讨论

与RAPD，AFLP，ISSR等分子标记相比，SSR为共显性标记，在整个基因组中广泛、随机和均匀分布，在单个位点的多态性更高，能高效准确检测大量的等位基因，是遗传学研究中最受欢迎的分子标记之一，是鉴定植物品种的理想分子标记[20-21]。本研究中的11对SSR标记来源于EST，与基因组SSR(gSSR)标记相比，源于基因转录区的EST-SSR标记的多态性与基因功能直接联系，通用性更高[22]。同时，荧光SSR标记与毛细管电泳相结合的检测技术能有效检测差别为1bp的片段变异，比传统检测方法更准确、高效和稳定。

研究物种的遗传多样性和种质间亲缘关系对解决育种和种质资源管理问题意义重大[14]。采用传统的SSR检测方法对柳树的遗传多样性和遗传结构分析已有报道，但基于荧光SSR标记的毛细管电泳分型技术在柳树中应用较少，仅见欧洲红皮柳(S.purpurea)[13]和北沙柳(S.psammophila)[15]中进行了遗传多样性分析，对于柳树种或品种之间的鉴定研究未见报道。本研究中，11对标记共获得56个等位片段，不同位点扩增的等位片段数3到8个不等，多态信息含量平均值为0.605 9，高于欧洲红皮柳的0.49[13]，与北沙柳的0.61[15]结果一致，表明SSR标记检测的有效性高。本研究中的9个柳树新品种通过3对核心引物的两两组合可有效鉴定，可见SSR对品种鉴定的可靠性较高。

聚类结果显示，9个柳树品种分为3个类群，第Ⅰ类群中，苏柳1701和苏柳1702为同一杂交亲本(二色柳×棉花柳)子代，遗传相似系数最高，亲缘关系最近，而苏柳1704的母本同为二色柳，与苏柳1701和苏柳1702亲缘关系较近；苏柳1703和苏柳1705聚在一起，可能是由于这2个品种的杂交亲本中母本均为簸箕柳。在第Ⅱ类群中，苏柳‘迎春’和苏柳‘紫嫣’聚在一起，分析原因，可能是由于苏柳‘迎春’为黄花柳种内杂交子代，而苏柳‘紫嫣’ (簸箕柳(♀)×黄花柳(♂))的父本同为黄花柳，且表型性状偏向父本黄花柳，从而聚在一起。虽然苏柳‘喜洋洋’和苏柳‘瑞雪’杂交亲本中母本与苏柳1701、苏柳1702、苏柳1704同为二色柳的相同个体，但不与其聚在一起，且亲缘关系较远，这可能与杂交子代的偏向性有关。从本研究结果来看，柳树杂交子代更多偏向于母本。

随着育种技术的不断进步，柳树新品种数量与日俱增，从而使品种鉴定、产权保护和资源管理等工作显得尤为重要。本研究首次基于荧光SSR标记构建了9个柳树新品种的指纹图谱，每个品种构建了唯一的分子身份证，极大地提高了品种鉴定效率。因此，此技术的应用对柳树品种鉴定和品种权保护意义重大。