郭 朵 彭艳华 杨洪敏 杨金凤

（中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院麻醉科，长沙410013）

原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，病人生存期短，死亡率高居所有肿瘤的第三位，且其发病率和死亡率均有继续上升的趋势[1]。目前，原发性肝癌的最主要治疗手段是手术切除。而在恶性肿瘤切除围术期，可能影响肿瘤病人预后的因素不仅有手术操作导致的肿瘤细胞的直接播散，还包括手术应激导致的免疫系统功能改变[2]，以及麻醉镇痛的方式和药物选择对恶性肿瘤病人预后带来的显著影响[3,4]。以往研究表明，阿片类药物具有免疫抑制作用，如经典阿片类药物吗啡能通过降低机体免疫力，从而促进肿瘤的生长与转移[5～7]，Hassan 等[8]发现，阿片类拮抗剂纳洛酮可以减少脾脏Tregs 细胞数量以加强小鼠的抗肿瘤免疫。但同时，疼痛抑制免疫[9]，阿片药物通过缓解疼痛，解除或降低疼痛对免疫功能的抑制，有利于肿瘤病人的预后。这些表明，无论是镇痛药物还是疼痛本身都可以影响肿瘤病人的预后。那么，肿瘤病人术后是否应该镇痛，选用何种药物镇痛，至今仍是困扰临床医师的问题。

盐酸氢吗啡酮是一种半合成阿片类麻醉药，在理化性质、临床镇痛等方面均优于吗啡，且不良反应更少，安全性更高[10]，但是盐酸氢吗啡酮用于术后镇痛对肿瘤病人免疫功能的影响却鲜有报道。以往文献表明，外周血调节性T 细胞(regulatory T cells, Tregs) 及自然杀伤细胞 (natural killer cells, NK)均与肿瘤免疫有密切的关系[11～15]。为此，本实验在二乙基亚硝胺(DENA)诱导的肝癌大鼠中，检测盐酸氢吗啡酮或吗啡腹腔持续镇痛对其外周血Tregs和NK 细胞水平的影响，以期评价在肿瘤个体中镇痛药物对其免疫功能的影响。

方 法

1.实验动物

雄性SD 大鼠，体重100～120 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院动物实验中心，采用24℃、12 h/12 h 照明周期环境，自由摄食饮水。

2.肝癌动物模型制备

SD 大鼠共90 只，予以50 mg/kg 0.19%二乙基亚硝胺（DENA，sigma，美国）腹腔注射，频率每周2 次，注射周期为12 周[16]。每4 周随机抽取2 只大鼠行肝脏病理学检查，直至肝癌大鼠造模成功。大鼠最终用HE 染色验证肝癌模型是否诱导成功。

3. 大鼠行肝叶切除手术并分组行术后镇痛

成功建立肝癌大鼠模型后，随机取45 只大鼠分为3 组：氢吗啡酮组（H 组）、吗啡组（M组）和生理盐水组（NS 组），每组15 只。大鼠经100%氧气及5%异氟醚（上海恒瑞医药，中国）诱导至夹尾无体动后，用2%异氟醚维持麻醉。在麻醉状态下，大鼠经腹部备皮、消毒后，在上腹部正中部依次切开皮肤、皮下组织、腹膜，暴露肝脏左外叶并用棉线根部结扎后切除该叶。清理腹腔后，将微量给药渗透压泵（容积2 ml，泵速10 μl/h，Alzet，美国）置入腹腔，用于术后镇痛。

微量给药渗透压泵的配方如下：H 组：盐酸氢吗啡酮（宜昌人福药业，中国）0.025 mg·kg-1h-1稀释至720 μl，以10 μl/h 速度匀速泵注3 天； M 组：吗啡（东北制药，中国）0.25 mg·kg-1h-1[17]加生理盐水稀释至720 μl，以10 μl/h速度匀速泵注3天。NS组：0.9%生理盐水720 μl，以10 μl/h 速度匀速泵注3 天。确认无出血后关腹，4-0 无菌缝线闭合创口。

4.疼痛行为学测试：机械性痛觉阈值 (mechanical pain threshold, MPT)

参照Offiah 等[18]报道的方法用标准的von Frey单纤维行腹部切口旁机械性痛觉阈值检测，具体如下：实验前大鼠置于测试笼中，使其充分适应环境3 h。用0.1～12 g 的单纤维测试针垂直于皮肤表面刺激大鼠腹部切口正中点向左旁开0.5 cm 处位置，直至纤维丝弯曲稍成S 形，持续5～6 s。若大鼠在刺激时间内或移开von Frey 纤维丝瞬间出现舔舐或抓挠受刺激区域，或出现突然退缩、跳跃，则记为阳性反应。使用Chaplan 等[19]的up-down 法测量，用Dixon[20]的方法计算该区域的MPT。每组大鼠检测的时间点包括术前(d0)，术后第1、3、7 天 (d1、d3、d7)。

5. 流式细胞学法检测Tregs 及NK 细胞占外周血单个核细胞百分比

大鼠在麻醉状态下，开胸，从右心耳用肝素湿润的5 ml 注射器取血4.5 ml。用生理盐水1:1稀释后，加入等量的细胞分离液。2 000 r/min 离心20 min，收集第二层环状乳白色淋巴细胞层（即PBMCs）。 收集的细胞经DPBS 洗涤、重悬，并调整细胞浓度至1×106/ml。在CD4+FoxP3+Tregs 细胞检测时，细胞悬液依次0.5 μg anti-Rat CD4 FITC (0.5 mg/ml, eBioscience)避光孵育15 min、PBS 洗3 次、2 ml 破膜缓冲液、PBS 洗3 次、5 μg anti-Rat FoxP3 PE (0.2 mg/ml, eBioscience)避光孵育30 min、PBS 洗3 次后重悬。在CD3-CD161+NK 细胞检测时，细胞悬液依次1 μg anti-Rat CD161 Alexa Fluor(0.2 mg/ml, BioLegend)避光孵育15 min、PBS 洗3 次、2 ml 破 膜 缓 冲 液、PBS 洗3 次、1 μg anti-Rat CD3 PE (0.2 mg/ml, eBioscience)避光孵育15 min、PBS洗3次并重悬。最后用流式细胞检测仪（FACSCalibur, BD Bioscience,美国）检测，利用FlowJo 软件分析CD4+FoxP3+Tregs 细胞和CD3-CD161+NK 细胞在PBMCs 中的百分比。

6. 统计学分析

采用SPSS 24.0 进行数据分析，计量资料用均数± 标准差(±SD) 表示。所有数据进行方差齐性检验，三组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，其后三组间进行两两比较，方差齐性时采用LSD-t 检验，方差不齐时，采用Dunnett's T3 检验 。P ＜ 0.05 认为差异具有统计学意义。

结 果

1.肝癌模型的鉴定

本实验采用DENA 腹腔注射的方法成功建立肝癌大鼠模型，最终死亡率为26.7% (24/90)，16 周后仍存活的大鼠荷瘤率为100%。正常肝脏中，肝小叶结构规则，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞无水肿变形（见图1A）。大鼠予DENA 注射4 周后，无大鼠死亡，病理切片可见部分肝细胞水肿（见图1B）；DENA 注射8 周后，大鼠死亡3 只(3/90)，光镜下观察见肝细胞明显肿胀、局灶性肝坏死、伴有炎性细胞浸润，并出现纤维组织增生 （见图1C）；DENA 注射12 周后，大鼠新增死亡8 只(8/87)，光镜下见脏脏组织显著纤维化、大量假小叶生成、汇管区大量炎性细胞浸润，可见癌细胞 （见图1D）；16 周后，大鼠新增死亡13 只(13/79) 光镜下见肝组织结构紊乱，细胞排列成大小不等的实性细胞团，大量异常核分裂象，肝癌形成 （见图1E）。

2. 疼痛行为学测试结果

在NS 组中，和术前相比，术后1、3、7 天的MPT 评分显著降低（P ＜ 0.05，见表1）。在M 组中，和术前相比，术后1、3 天的MPT 评分显著降低。在H 组中，和术前相比，术后1、3天的MPT 评分显著降低。和NS 组相比，H 组和M 组在术后1、3、7 天的MPT 评分显著增加(P ＜ 0.05)； 但H 组和M 组之间无显著差别（P ＞ 0.05，见表1）。

3. 肝癌大鼠外周血Tregs 和NK 细胞水平变化

与术前相比，三组大鼠在术后第3、7 天 Tregs细胞百分比均升高(P ＜ 0.05)，NK 细胞百分比均降低(P ＜ 0.05)。和NS 组相比，H 组和M 组在术后3、7 天 Tregs 细胞百分比更低(P ＜ 0.05)，而NK 细胞占比更高(P ＜ 0.05)。在术后第7 天时，和M 组比，H 组Tregs 细胞百分比更低(P ＜ 0.05)，NK 细胞占比更高（P ＜ 0.05，见图2）。

讨 论

影响肿瘤手术病人预后的最主要因素是免疫因素。而Tregs 和NK 细胞是评价细胞免疫功能的重要指标。自然杀伤细胞是机体自然免疫的主要承担者，在对抗肿瘤的第一道防线中扮演关键角色，既往研究显示：肝癌病人外周血及肝脏组织中的NK细胞数量显著低于正常人，且NK 细胞水平与肝癌病人的预后呈正相关[21]。肝癌病人外周血中Tregs细胞占比显著高于正常人群[22]，Tregs 细胞占比升高程度与肿瘤的分期相关，Tregs 细胞水平的升高被认为是预后的不利因素[23]；阻滞Tregs 细胞相关通路或直接去除Tregs 细胞能促进机体抗肿瘤免疫[24]。

图1 肝癌大鼠肝脏病理学变化 (A)大鼠正常肝脏组织；(B) DENA 注射4 周后大鼠的肝脏组织，箭头所示位置为细胞水肿；(C) DENA 注射8 周后大鼠的肝脏组织，箭头所示位置为浸润的炎性细胞；(D) DENA 注射12 周后大鼠的肝脏组织，大量假小叶形成，箭头所示位置为纤维增生伴有大量炎性细胞浸润；(E) 16周后大鼠的肝脏组织，肝小叶结构消失，肝细胞异行增生，呈巢团状排列Fig. 1 Pathological changes of liver in rats with hepatocellular carcinoma (A) Liver tissue from healthy rats; (B) Liver tissue from rats injected with DENA for 4 weeks. At the arrow are the edematous hepatocytes; (C) Liver tissue from rats injected with DENA for 8 weeks. The arrows indicate infiltrating inflammatory cells; (D) Liver tissue from rats injected with DENA for 12 weeks. Numerous pseudolobules are formed, with fibrous proliferation at the arrow and extensive inflammatory cell infiltration; (E) Liver tissue of rats after 16 weeks. The hepatic lobule structure disappeared and the hepatocytes proliferated in a nest-like arrangement.

表1 腹部切口旁机械性痛觉阈值(g, n = 5, ±SD)Table 1 MPT beside abdominal incision (g, n = 5, ±SD)

表1 腹部切口旁机械性痛觉阈值(g, n = 5, ±SD)Table 1 MPT beside abdominal incision (g, n = 5, ±SD)

组别Groups NS M H术前(d0) 3.96±1.05 4.11±1.53 3.38±0.67术后1 天(d1) 0.56±0.14# 1.66±0.27*# 1.83±0.31*#术后3 天(d3) 1.04±0.16# 2.15±0.61*# 2.16±0.52*#术后7 天(d7) 1.81±0.61# 2.90±0.35* 3.12±0.47*

术后疼痛可抑制机体免疫功能，Page 等[25]发现，未能良好控制的术后疼痛会导致NK 细胞活性的下降，增加术后肿瘤扩散的风险。本实验中采用肝癌大鼠肝叶切除模型，并采用盐酸氢吗啡酮或*P ＜ 0.05，与N 组相比；#P ＜ 0.05，与d0 相比；*P ＜ 0.05, compared with group NS;#P ＜ 0.05, compared with d0.吗啡腹腔持续给药术后镇痛，与生理盐水对照观察不同时间段外周血中Tregs 和NK 细胞的变化，发现三组大鼠术后均出现Tregs 细胞比例增加和NK细胞比例下降，尤其是未采用术后镇痛的生理盐水组更为明显，充分证明手术应激和术后疼痛影响了肝癌大鼠细胞免疫功能。

加强肿瘤病人术后镇痛可能能改善其预后。本试验发现盐酸氢吗啡酮和吗啡都可以为肝癌大鼠肝叶切除术后提供满意的镇痛效果，较生理盐水组相比，盐酸氢吗啡酮和吗啡可以显著减少外周血Tregs 细胞占PBMCs 的百分比并增加NK 细胞占PBMCs 的百分比，充分证明术后疼痛控制能显著改善肝癌大鼠细胞免疫功能，而且术后第7 天，盐酸氢吗啡酮组大鼠较吗啡组大鼠相比，Tregs 细胞占PBMCs 的百分比更低，NK 细胞占PBMCs 的百分比更高，说明盐酸氢吗啡酮较吗啡相比更能使肝癌大鼠术后细胞免疫功能快速恢复。

盐酸氢吗啡酮与吗啡都属于μ 受体激动剂，盐酸氢吗啡酮的镇痛强度为吗啡的8～10 倍，且盐酸氢吗啡酮静脉使用较吗啡不良反应少，成瘾率低，有助于改善病人不良情绪[26]。而Osborne 等[27]发现孕期的情绪对Tregs 细胞有显著影响。盐酸氢吗啡酮和吗啡对外周免疫的差异调节机理是否与其情绪调节有关仍需进一步探索。

图2 肝癌大鼠外周血Tregs 和NK 细胞水平变化(A) Tregs 细胞占PBMCs 的百分比(n = 5, ±SD) *P ＜ 0.05，与d0 相比；#P ＜ 0.05，与NS 组相比；△P ＜ 0.05，与M 组相比； (B) NK 细胞占PBMCs 的百分比 *P ＜ 0.05，与d0 相比；#P ＜ 0.05，与NS 组相比；△P ＜ 0.05，与M 组相比； (C) 流式细胞技术分别检测NS 组、M 组、H 组大鼠在术前、术后第3 天、7 天外周血中CD4+ FoxP3+ Tregs 细胞占PBMCs 的百分比 (D) 流式细胞技术分别检测NS 组、M 组、H 组大鼠在术前、术后第3 天、7 天外周血中CD3-CD161+ NK 细胞占PBMCs 的百分比Fig. 2 Tregs and NK cells levels in peripheral blood of HCC rats (A) The percentage of Tregs cells in PBMCs (n = 5, ±SD) *P ＜ 0.05, compared with d0; #P ＜ 0.05, compared with group NS; ∆P ＜ 0.05, compared with group M. (B) The percentage of NK cells in PBMCs *P ＜ 0.05, compared with d0; #P ＜ 0.05, compared with group NS; ∆P ＜ 0.05, compared with group M. (C) Flow cytometric analysis of the percentage of CD4+ FoxP3+ Tregs cells of PBMCs in normal saline group，morphine group and hydromorphone group of rats before surgery, d3 and d7 after surgery. (D) Flow cytometric analysis of the percentage of CD3-CD161+ NK cells of PBMCs in normal saline group, morphine group and hydromorphone group of rats before surgery, d3 and d7 after surgery.

细胞免疫功能的影响是一个动态过程，本实验的缺陷在于：没有持续观察大鼠肝癌模型期间细胞免疫功能的动态变化；术后7 天，三组大鼠细胞免疫功能未完全恢复正常，未观察细胞免疫功能恢复的时间；大鼠术后生存时间未进一步观察。