●赵国清 尹斐斐 张婷婷 韦雪华 孙蓉蓉 王贵升

（1. 威海市畜牧业发展中心 山东 威海 264200；2. 青岛市动物疫病预防控制中心 山东 青岛 266071；3. 山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 250022）

自2014 年起，随着我国水貂、狐狸等毛皮动物养殖量的下降，毛皮动物感染性疫病的种类出现了较大变化，其中混合感染显著增多，并且不断出现新的临床症状[1]。为了更全面地了解山东地区毛皮动物疫病的流行情况，我们在2019 年对山东省菏泽、济宁、临沂、日照、泰安、威海、潍坊、烟台和淄博9 个地区毛皮动物养殖场的病死水貂、狐狸和貉子的疫病感染情况进行了病原鉴定以及致病菌的药敏试验，掌握了山东省当前毛皮动物疫病流行现况和病原特性，为进一步防治疾病提供了基础。

1 材料与方法

1.1 病料

2019 年1～12 月，我们采集了来自山东省菏泽、济宁、临沂、日照、泰安、威海、潍坊、烟台及淄博9 个地区规范化毛皮动物养殖场的病死水貂、狐狸及貉子的脑、肠、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏和心脏等组织样品共340 份。

1.2 主要仪器及试剂

荧光定量PCR仪（ABI QuantStudio 5）、细菌鉴定仪及配套鉴定卡（法国梅里埃VITEK2-COMPACT）、病毒DNA/RNA提取试剂盒（北京森康生物技术开发有限公司）、病毒荧光定量PCR检测试剂盒（北京森康生物技术开发有限公司）、细菌培养基（青岛海博生物技术有限公司）。

1.3 水貂、狐狸和貉子发病情况调查及记录

对发病水貂、狐狸及貉子的临床症状、饲养管理、免疫预防等方面进行详细记录，分析疫病流行特点；剖检病死动物，记录主要病理变化和特征病变，作为确诊的参考依据。

1.4 实验室检测方法

1.4.1主要病毒病的荧光定量PCR检测无菌采集病死水貂、狐狸及貉子的肝脏、肺脏和脑等病料，参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取病毒核酸，通过荧光定量PCR方法分别检测犬瘟热病毒、细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒和流感病毒。

1.4.2 细菌分离鉴定无菌采集病死水貂、狐狸、貉子的肝脏、肺脏和脑等病料，在麦康凯培养基和SS培养基血平板上分别划线接种，在37℃恒温培养箱内培养16h。对培养基上生长出来的细菌镜检观察后，分别挑取单个菌落进行革兰氏染色，挑选典型菌落的生长菌进行纯化培养后，用VITEK2-COMPACT细菌鉴定仪进行细菌的生化鉴定和药敏试验，鉴定革兰氏阴性菌使用GN卡片，鉴定革兰氏阳性菌使用GP卡片。

1.5 病原感染的统计分析

对340 份毛皮动物病料样品检测分离到的病原种类逐份记录，统计每种致病原的阳性率以及多重感染的比率。

2 结果

2.1 病毒检测结果

2.1.15 种病毒的检出率采集的340 份病料中细小病毒（MEV）、犬瘟热病毒（CDV）、伪狂犬病毒（PRV）、圆环病毒（PCV）及流感病毒（AIV）的检测结果，见图1。检测结果表明：犬瘟热病毒的检出率最高（23.08%），其他4 种病毒的检出率都低于5%，其中伪狂犬病毒的检出率最低，全部病料只检出2 份，检出率只有0.59%。检测结果说明犬瘟热在山东省毛皮动物疫病中发病较为普遍。

图1 山东省9 地区毛皮动物5 种病毒的检出率

2.1.25 种病毒不同季节的发病情况山东省菏泽、济宁等9 个地区毛皮动物5 种病毒不同月份的检出率统计，见图2。毛皮动物犬瘟热的发病时间主要在7 月、10 月和11 月，其中10 月发病率最高；毛皮动物细小病毒病的发病时间主要在6 月、11 月和12 月，其中12 月发病率最高；毛皮动物伪狂犬病的发病时间主要在6 月和10 月，其中6 月发病率最高；毛皮动物圆环病毒病的发病时间主要在2 月，其他月份未检出；毛皮动物流感的发病时间主要在2 月和9 月，其中2 月发病率最高。

图2 山东省9 地区毛皮动物5 种病毒在不同月份的检出情况

2.1.3山东不同地区毛皮动物5 种病毒的检出情况山东省9 个地区毛皮动物5 种病毒检出率的统计，见图3。毛皮动物犬瘟热病毒在烟台、日照、淄博、威海和潍坊等沿海地区检出率相对较高，其中烟台毛皮动物的犬瘟热病毒检出率最高，达68.5%，济宁、泰安毛皮动物犬瘟热病毒检出率为0；水貂细小病毒在济宁地区毛皮动物中检出率最高，达60%，而其他地区毛皮动物细小病毒的检出率较低，在日照、泰安、烟台、潍坊、淄博等地区水貂细小病毒的检出率为0；流感病毒在济宁和泰安的毛皮动物中检出率均为33.3%，其他地区的检出率基本为0；圆环病毒在烟台地区毛皮动物中的检出率较高，达14.29%；伪狂犬病毒仅在潍坊和临沂的毛皮动物中各检出1 例。

图3 山东省9 地区毛皮动物5 种病毒的检出情况

2.2 细菌检测结果

对分离培养的细菌进行生化鉴定及药物敏感试验，确定山东省9 个地区的毛皮动物感染的主要致病菌有大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas）、绿脓杆菌（Pseudomonas）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae complex）、不动杆菌（Acinetobacter）等，其中大肠杆菌检出比例占10.3%。山东省9 个地区毛皮动物各细菌的检测结果，详见表1。对检出的主要致病菌进行药物敏感试验，结果见表2。

表1 细菌检测结果

表2 主要致病菌药敏实验结果

2.3 病原混合感染统计

对山东省9 个地区采集的340 份毛皮动物病料的病毒性、细菌性感染病原进行分类汇总，结果显示，毛皮动物犬瘟热病毒、水貂细小病毒、禽流感病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒以及大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌等之间的单独感染、二重感染、三重感染的比例分别为40.5%、43.2%、16.3%，主要为病毒与细菌之间的混合感染，未发现三重以上感染情况。

3 讨论与分析

本实验主要对2019 年山东省9 个地区毛皮动物常见感染性疫病的发病情况进行流行病学调查，检测了犬瘟热病毒、水貂细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒和流感病毒等5 种病毒，并对分离的细菌进行了培养鉴定。检测结果表明：毛皮动物犬瘟热病毒检出率达到23.08%，说明犬瘟热病毒是危害山东地区毛皮动物养殖业的重要病原。目前，水貂等毛皮动物犬瘟热疫苗免疫接种率基本达到100%，但是感染率仍然比较高。分析其感染的原因，一是犬瘟热病毒出现了变异株的流行[2-3]，变异株H基因在I542N和Y549H出现了突变，N-糖基化位点的潜在个数增加了1 个，对毛皮动物特别是水貂的毒力和免疫抑制作用变强[4]；二是免疫程序不当，不同日龄的毛皮动物仔兽的接种时间存在“一刀切”做法，导致母源抗体干扰或造成免疫空白期[5]，引起免疫失败。根据母源抗体消长规律，在仔兽45 日龄左右初次免疫接种犬瘟热疫苗和细小病毒性肠炎疫苗效果较好[6-7]。养殖场需要及时测定仔兽体内的母源抗体水平，分批次进行免疫；另外，调查发现毛皮动物混养情况普遍，由于水貂、狐狸、貉子对犬瘟热病的易感性显著不同[4]，容易造成三者的交叉传播。

目前，山东地区毛皮动物养殖中病毒、细菌混合感染较突出[8]，单独感染、二重感染的比例较大，也时常出现三重感染，并不断出现新的临床症状，单靠临床经验很难做出准确诊断，须依靠PCR等实验室方法进行鉴别确诊[9]。研究表明，导致水貂出血性肺炎的常见细菌已由传统认为的绿脓杆菌扩展到肺炎克雷伯氏杆菌、葡萄球菌和大肠杆菌等[10]。混合感染发病可明显加重毛皮动物病情，且死亡率较高，增加了防治的困难。

从检出月份来看，山东9 个地区毛皮动物发病时间有明显的季节性。犬瘟热病、水貂细小病毒病和伪狂犬病多集中在夏季和秋末冬初发病，而春季发病率较低；圆环病毒病和流感病毒病的发病季节相近，主要在初春比较干燥寒冷的季节发病。从不同地区各病毒的检出情况来看，毛皮动物犬瘟热病在烟台、日照、淄博、威海及潍坊等沿海地区的检出率相对较高；水貂细小病毒病在济宁地区检出率最高；毛皮动物流感病毒病在济宁和泰安的检出率较高；毛皮动物圆环病毒病在烟台地区的检出率较高；而毛皮动物伪狂犬病毒病仅在潍坊和临沂各检出1例。结果说明毛皮动物犬瘟热病的发病地区主要集中在沿海，地区差异明显，造成这些差异的原因可能与沿海地区毛皮动物养殖量大、饲养密度大、部分养殖户管理滞后有关。

本次试验中，从采集的毛皮动物病料中分离出的所有病菌中，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌阳性率位居前3 位。研究表明，这3 种细菌均能导致水貂等毛皮动物出现腹泻或呼吸道症状，肺炎克雷伯氏菌在近几年毛皮动物呼吸道症状和神经症状的病例检测中的分离率显著增高[11]，在毛皮动物腹泻病例中也有分离出肺炎克雷伯氏菌的报道[1]。另外，毛皮动物奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的检出率在2%左右，它们也能导致水貂等毛皮动物产生腹泻或呼吸道症状及败血症，提示临床诊断中要加强致病原的鉴别诊断，避免误诊。

近年来，由于畜牧业中不规范使用抗生素的情况较普遍[12]，致使养殖的毛皮动物对细菌的耐药性广泛存在。研究报道，山东部分地区养殖的水貂分离的貂源致病菌株中含耐药基因的比例较高，大肠杆菌中3 种及以上耐药基因的检出比例达48.1%[13]，肺炎克雷伯氏菌中ESBLs的耐药基因检出率超过70%，对22 种常用抗菌药物表现出不同程度的耐药性[11]。从本次分离致病菌的药敏实验结果得出：7 种分离菌均有不同程度的耐药性：大肠杆菌主要对哌拉西林钠他唑巴坦、头孢替坦、厄他培南、亚胺培南、阿米卡星及呋喃妥英等相对比较敏感；肺炎克雷伯氏菌主要对哌拉西林钠他唑巴坦、头孢替坦、厄他培南、亚胺培南、阿米卡星及庆大霉素等相对比较敏感；绿脓杆菌的敏感药物主要是哌拉西林钠他唑巴坦、头孢他啶、厄他培南、阿米卡星、庆大霉素及妥布霉素等；阴沟肠杆菌药敏结果比较特殊，对头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南及阿米卡星的敏感率达到100%，而对其他药物的敏感率为0。本实验通过药敏实验确定敏感药物，可以对毛皮动物疫病有针对性地进行药物对症治疗，对防止抗生素滥用起到一定的作用。下一步，应按照《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017-2020 年）》[14]的要求，加强对毛皮动物养殖环节使用抗生素的监管，遏制细菌耐药性的产生，防止耐药基因通过食物链等途径在动物与人之间传播扩散，保护动物和人类健康。