林 静邵 康王 锴张 聪滕渊洁潘再法佘远斌

(浙江工业大学化学工程学院，浙江杭州 310000)

1 引 言

铁是人体必需的微量元素之一[1]，作为人体中重要的生命要素[2]，在人体的新陈代谢过程中具有重要作用[3]。缺铁会导致人体的免疫力降低，出现缺铁性贫血。通常情况下，摄入铁的主要方式有食补和补铁保健品，其中服用补铁口服液是最为常见的方法。补铁口服液具有补气补血的效果，可有效增强人体中的含氧量，改善气血循环。但是过度摄入铁则会导致组织损伤、器官衰竭甚至死亡[4]，因此测定补铁口服液中铁元素的含量具有非常重要的意义。

常见铁的测定方法有分光光度法[5]、原子吸收光谱法[6]、比色法[7]、荧光光谱法[8]等。相比于其他检测方法，荧光光谱法具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点[9-11]，可实现Fe3+含量的简便快速检测。至今为止，已有研究人员采用多种荧光材料构建荧光探针用于检测Fe3+的含量，但是大多检测Fe3+含量的探针尚存在一些缺点，如背景干扰大、选择性不强或随pH值变化影响等[12-14]。2017年，Jiang等合成一种星形三苯并噻唑基苯(TBB)作为荧光探针检测水中的Fe3+，TBB的荧光性能受到pH的影响较大，在强碱性环境下具有良好的耐受性，但在强酸的条件下会发生质子化，导致电荷转移引起荧光变化，对Fe3+的测定会产生干扰[15]。2019年，Jayaweera等[16]采用榴莲壳为原料制备荧光碳点，用于检测水体中的Fe3+，采用365 nm作为最佳激发波长，可产生蓝色荧光，但无法实现免实时激发检测，未能有效避免激发光产生的背景干扰。Ye等[17]采用掺杂镧系配位聚合物制备碳点构建比率型荧光传感用于自来水中Fe3+的定量检测。目前检测Fe3+含量的荧光探针大多无法避免激发光和复杂样品自体荧光的干扰，常应用于水样或其他简单样品的实际测定，在复杂样品的Fe3+检测方面仍需进一步探究。因此，开发新型荧光探针用于复杂样品中Fe3+的快速准确检测具有重要意义[18]。

长余辉材料又称为夜光材料，在经过外界光源激发之后，可将能量储存在陷阱中，在停止激发后仍可持续发光，在安全显示、光电储存、仪表显示以及生物成像等领域具有广泛的应用[19]。由于长余辉材料在停止激发后，仍具有较强荧光，因此可做到免实时激发检测，有利于消除激发光源及复杂样品自体荧光的干扰。另外，由于长余辉材料具有独特的余辉特性，不需要采用具有荧光时间分辨功能的昂贵仪器，就可实现磷光的时间分辨测定，可有效消除复杂样品的自体荧光的干扰，实现无背景干扰下的高信噪比检测[20-21]。2010年，严秀平等[22]首次利用 Ca1.86Mg0.14Zn-Si2O7∶Eu2+，Dy3+与金纳米粒子结合，根据荧光共振能量转移(FRET)机理构建绿光长余辉荧光探针，并成功应用于血清样品中甲胎蛋白(AFP)的检测，有效地避免了血清样品的自体荧光和激发光的干扰，检出限低至0.41 μg/L。2018年，Hu等[23]采用绿光长余辉材料Sr2Al14O25∶Eu2+，Dy3+构建荧光传感用于抗生素和2，4，6-三硝基酚(TNP)的检测，该生物传感器有效地避免了背景干扰并成功地应用于牛奶、水样中污染物的检测。陈学元等[24]制备了近红外长余辉材料ZnGa2O4∶Cr3+，将其进行生物素化后用于构建荧光传感体系，有效地避免了蛋白质自体荧光的影响，可在白光激发下实现重复激发，实现了亲和素蛋白的异构测定。

在长余辉材料中，采用Cr3+掺杂的镓酸盐长余辉材料具有良好的化学稳定性，可在强酸强碱等环境下保持良好的发光性能，并在近红外区域具有较强的荧光发射。由于Cr3+掺杂的镓酸盐长余辉材料具有良好的余辉性能、化学稳定性和组织透过性等优点[25]，在生物成像和荧光传感领域具有广泛的应用前景，受到了广大研究者的密切关注。因此本文采用水热法合成Sn4+共掺的近红外长余辉材料ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+(ZGSC)，并进一步进行包硅处理，以获得良好的水中分散性。利用Fe3+对所合成的长余辉纳米探针的猝灭效应，建立了操作简便、选择性强、干扰小的荧光传感方法，实现补铁口服液中Fe3+的含量高选择性检测。并且采用时间分辨光谱可有效地消除背景干扰，获得高信噪比。市面上大多补铁口服液的有效价态是二价铁[26]，但目前报道的通常是测定补铁口服液中的总铁含量。本文可以分别测定补铁口服液中的总铁含量和Fe3+的含量，并根据总铁含量和Fe3+的含量计算出二价铁的含量，具有分别检测Fe3+与Fe2+的优点。

2 实 验

2.1 长余辉材料的合成

按照化学计量比称取1 mmol Zn(CHCOO)2·2H2O、2 mmol Ga(NO3)3·xH2O、0.002 mmol Cr(CHCOO)3·2H2O及0.004 mmol SnCl4·5H2O溶于20 mL去离子水中，搅拌1 h。加入NaOH(2 mol/L)调节pH＝11，继续搅拌2 h后，将反应物转移至25 mL的水热反应釜中，反应釜于200℃下反应18 h，待冷却后离心，并用去离子水和无水乙醇洗涤3次，沉淀物置于烘箱中在60℃下干燥12 h，得到水热后的长余辉纳米材料。再将产物转移至刚玉坩埚中，设置升温速率为10℃/min，于1 000℃煅烧4 h，冷却至室温后，用研钵研磨，得到产物ZGSC。

称取30 mg煅烧后的ZGSC，加入24 mL无水乙醇、0.1 mL硅酸四乙酯及1.44 mL氨水，搅拌反应4 h。再转移至离心管中离心，采用去离子水与无水乙醇各洗涤3次，沉淀物置于烘箱中于60℃下干燥12 h，得到在表面包覆上硅壳的长余辉纳米材料ZGSC＠SiO2。

2.2 测定条件优化及选择性实验

采用HCl溶液(0.1 mol/L)和 NaOH溶液(0.1 mol/L)配制 pH 为 5，6，7，8，9，10，11，12，13的溶液，备用。分别取200 μL不同pH的溶液与100 μL ZGSC＠SiO2混合均匀，测定混合溶液的荧光光谱，考察pH值对长余辉探针荧光强度的影响。

配制浓度为 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5 mg/mL 的 ZGSC＠ SiO2水分散液，测定不同浓度ZGSC＠SiO2水分散液的荧光光谱，考察ZGSC＠SiO2水分散液浓度对长余辉探针荧光强度的影响。

配制浓度为10-2mol/L的 K+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Cu2+、Co2+、Cd2+、Cr3+、NH4+、Mn2+和 Ag+等金属离子溶液备用。分别取200 μL的金属离子溶液与100 μL ZGSC＠SiO2混合均匀，测定混合溶液的荧光光谱，考察不同金属离子对长余辉探针荧光强度的影响。

2.3 Fe3+的定量测定及标准曲线制作

配制不同浓度的 Fe3+溶液，分别取100 μL ZGSC＠SiO2与200 μL Fe3+溶液混合，搅拌1 min后，选择254 nm为激发波长，测定混合物的发射光谱。以最大发射波长695 nm处的荧光强度对Fe3+浓度作图，得到Fe3+的标准曲线，用于实际样品中的Fe3+浓度定量测定。

2.4 实际样品检测

选择3种不同的市售补铁口服液(10 mL/支)作为实际样品，取适量体积的补铁口服液样品稀释至50 mL使得待测样品的浓度在Fe3+的线性范围内，定容备用。分别取100 μL ZGSC＠SiO2、100 μL 双氧水与100 μL 待测样品于比色皿中，超声1 min混合均匀。其中补铁口服液中的Fe2+可被双氧水氧化为Fe3+，故可测定样品中的总铁含量。测定混合物的发射光谱，计算总铁含量。 取 100 μL ZGSC＠ SiO2、100 μL 去离子水与100 μL待测样品混合均匀，超声1 min，测量混合物的发射光谱，测定样品中Fe3+的含量。计算总铁含量和三价铁含量的差值，可得样品中Fe2+的含量。

2.5 仪器与测试

采用Fluoromax-4P荧光光谱仪(法国HORIBA Jobin Yvon公司)测定长余辉材料的发射光谱，ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+的激发波长为 254 nm，发射光谱的监测波长为695 nm。X'pert PRO X射线衍射仪(荷兰PANlytical公司)用于测定样品的X射线衍射谱。采用高分辨透射电子显微镜(荷兰Tecnai G2 F30)分析样品的形貌，加速电压300 kV。

3 结果与讨论

3.1 长余辉材料的结构表征

ZnGa2O4晶体具有立方尖晶石结构(空间组Fd3m)，Zn2+占据四面体格位(Td)，占据八面体格位(D3d)。由于掺杂的Cr3+离子与Ga3+具有相同的原子价和相似的离子半径(0.061 5 nm vs.0.062 nm)，因此它们优先占据晶体Ga3+位置[27]。同时掺杂 Cr3+与 Sn4+可有效地提升ZnGa2O4的余辉性能。采用X射线衍射仪(XRD)以及高分辨透射电子显微镜(TEM)对长余辉材料的晶体结构和尺寸形貌进行表征分析。分别对1 000℃高温煅烧后的ZGSC以及包硅之后的ZGSC＠SiO2两种样品进行了XRD表征，如图1所示。两种不同阶段长余辉材料的XRD图谱均与ZnGa2O4的标准卡片相符。从图1中可看出，经过煅烧之后ZGSC的峰尖且窄，说明经过煅烧后样品结晶性完好，包硅处理均未改变长余辉材料的晶体结构。图2分别为水热处理、高温煅烧及包硅处理之后的ZGSC的TEM图。

图1 ZGSC和 ZGSC＠SiO2的XRD图，ZnGa2O4的标准卡片为PDF#86-0413。Fig.1 XRD of ZGSC and ZGSC＠ SiO2.The standard card of ZnGa2O4is PDF#86-0413.

图2 (a)～(b)ZGSC的透射电镜图；(c)1 000℃煅烧后ZGSC的透射电镜图；(d)包硅处理后ZGSC＠SiO2的透射电镜图。Fig.2 (a)-(b)TEM and HRTEM images of ZGSC.(c)TEM of ZGSC after 1 000℃calcination.(d)TEM of ZGSC＠SiO2.

图2 (a)、(b)均为水热处理之后长余辉材料的TEM图。从图2(a)中可观察到水热反应获得的ZGSC粒径较小，其平均粒径均小于50 nm，且晶体粒径较为均一。从图2(b)中可观察到水热制得的ZGSC具有清晰的晶格条纹，其间距为0.158 nm，由此可说明水热反应制得的ZGSC结晶性良好。图2(c)为1 000℃煅烧后ZGSC的TEM图，从图中可观察到，其晶体大小较为均匀，经过煅烧后晶体粒径有所增大，但其平均粒径均小于200 nm。图2(d)为包硅处理后ZGSC＠SiO2的TEM图，从图中可观察到在ZGSC表面包覆了一层明显的硅层，经过包硅之后，ZGSC表面修饰上大量的硅羟基Si—OH，因此ZGSC的亲水性得到有效地提高，从而提升了ZGSC在水相中的分散性。并且经过包硅处理，ZGSC＠SiO2可在水相中稳定分散1 h以上，由此说明包硅效果良好。

3.2 荧光性能表征

长余辉材料的激发发射光谱如图3所示，从激发光谱图中可观察到，通过监测695 nm处的发射，在紫外-可见区存在以254，369，497 nm 为中心的3个宽激发带。其中在254 nm处有一强的激发带可归因于带间跃迁(CB→VB)及Cr3+的4A2(4F)→4T1(4P)跃迁，在369 nm和497 nm处的两个峰分别是由于Cr3+的4A2(4F)→4T1(4F)和4A2(4F)→4T2(4F)的跃迁产生。从发射光谱图中可看出，在254 nm激发下，可观察到600～800 nm的近红外区有一个宽的发射带，其峰值位于695 nm，可归因于2E→4A2跃迁。

图3 ZGSC＠SiO2的激发和发射光谱Fig.3 Excitation and emission spectra of ZGSC＠ SiO2

除了激发光谱和发射光谱之外，还测定了ZGSC＠SiO2的衰减曲线和时间分辨光谱(TR)。如图4所示，采用254 nm作为激发光源，对长余辉材料进行充能，5 min之后关闭激发光源，300～600 s为衰减过程。首先是快速衰减过程，激发停止之后产生快速衰减的原因是被较浅的陷阱所捕获的电子快速释放；随后是慢速衰减过程，慢速衰减是由于较深陷阱中的电子被缓慢释放所导致。从图4中可看出，经过包硅处理后，ZGSC＠SiO2在激发后所存储的能量增大，且衰减速度没有变快。由此可看出，包硅处理可有效地提高ZGSC的余辉性能。

图4 ZGSC和ZGSC＠SiO2的衰减曲线Fig.4 Decay curves of ZGSC and ZGSC＠ SiO2

为了消除背景荧光的干扰，本文还测定了ZGSC＠SiO2在 I＝I0/e时(取 300 μs)的时间分辨光谱(TR)，结果如图5所示。从图5中可以看出，在600～650 nm处，稳态光谱基线明显比时间分辨光谱的基线高，这是由于激发光源存在下的背景干扰。以695 nm处的荧光信号强度除以600 nm处的背景噪音强度，通过计算可得到稳态下信噪比为5.9，时间分辨光谱中信噪比为42.7。可见利用时间分辨光谱，信噪比大幅提高，可有效地消除背景干扰，在时间分辨生物传感等领域具有广泛的应用前景。

图5 ZGSC＠SiO2在稳态和时间分辨的发射光谱Fig.5 Steady state and time resolved emission spectra of ZGSC＠SiO2

3.3 测定条件优化及选择性实验

图6 (a)ZGSC＠SiO2在不同pH值环境中的荧光强度；(b)不同浓度ZGSC＠SiO2水分散液的荧光强度。Fig.6 (a)Fluorescence intensity diagram of ZGSC＠ SiO2in different pH.(b)Fluorescence intensity of ZGSC＠SiO2water dispersion with different concentrations.

使用长余辉材料ZGSC＠SiO2作为荧光探针，其荧光强度会受到环境中pH值以及ZGSC＠SiO2在水分散液中浓度的影响，故需对以上两种因素进行考察优化。为探究环境中不同pH值是否会对ZGSC＠SiO2荧光强度产生影响，本文分别测定了pH＝5～13的环境下ZGSC＠SiO2的荧光强度，结果如图6(a)所示。在不同的pH环境中，ZGSC＠SiO2的荧光强度基本保持不变，不同pH值并不会对ZGSC＠SiO2的荧光性能产生较大影响，说明ZGSC＠SiO2具有良好的pH稳定性，因此ZGSC＠SiO2可用于广泛pH范围内的检测。

为探究分散在水溶液中长余辉材料的浓度对荧光强度的影响，我们测定了不同浓度ZGSC＠SiO2的荧光发射光谱，取695 nm处的荧光强度进行对比，结果如图6(b)所示。随着ZGSC＠SiO2浓度的不断增大，其荧光强度呈现先增大后稳定的趋势。当浓度为0.6 mg/mL时，ZGSC＠SiO2的荧光强度达到最大值；当浓度大于0.6 mg/mL时，ZGSC＠SiO2的荧光强度逐渐趋于稳定。因此，选择0.6 mg/mL作为ZGSC＠SiO2测定的最佳浓度。

除此之外，为探究近红外长余辉材料ZGSC＠SiO2检测Fe3+的可行性，我们考察了本传感系统的选择性。分别配制了浓度为10-2mol/L的不同金属离子溶液，加入一定量的ZGSC＠SiO2水分散液中混合，测定其荧光强度，从而探究常见阳离子 K+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cr3+、Co2+、NH4+、Mn2+、Ag+、Cd2+对 ZGSC＠SiO2荧光性能的影响，实验结果如图7所示。从图7中可看出，加入其他常见阳离子后，ZGSC＠SiO2荧光强度没有变化或变化不大，仅有Fe3+可使ZGSC＠SiO2荧光强度产生大幅猝灭的现象。加入浓度为10-2mol/L的Fe3+之后，长余辉材料ZGSC＠SiO2的荧光被大幅猝灭，其猝灭效率达到了96.72%。

图7 加入不同阳离子后ZGSC＠SiO2的荧光强度图Fig.7 Fluorescence intensity of ZGSC＠ SiO2in the presence of various ions

由此表明，长余辉材料ZGSC＠SiO2对Fe3+具有良好的选择性，可用于实际样品中Fe3+含量的选择性检测。Fe3+可使ZGSC＠SiO2产生荧光猝灭的原因可能是由于长余辉材料与Fe3+之间产生了光电子转移。即由于ZGSC＠SiO2的表面含有大量的羟基，加入Fe3+后，ZGSC＠SiO2表面的羟基与Fe3+发生配位反应，可能导致激子的非辐射复合概率增加，从而产生猝灭效应[28-31]。

3.4 Fe3+的定量测定及标准曲线制作

基于Fe3+可使ZGSC＠SiO2产生荧光猝灭的现象，本研究建立了一种快速检测Fe3+的传感方法。为了探究Fe3+溶液的浓度与ZGSC＠SiO2荧光强度之间的关系，向ZGSC＠SiO2中加入浓度为0～10-2mol/L的Fe3+溶液后，测定了ZGSC＠SiO2在254 nm激发时的发射光谱，如图8(a)所示。从图中可以看出，随着 Fe3+的浓度在0～10-2mol/L之间不断地增大，ZGSC＠SiO2的荧光强度逐渐减弱，猝灭程度逐渐增大。选取695 nm处的荧光强度与Fe3+的浓度绘制标准曲线，结果如图8(b)所示。在50～800 μmol/L之间，荧光强度与Fe3+之间具有良好的线性关系，线性方程为y＝ -6.4×104×lgC-1.9×105(R2＝0.998 5)，其中y为ZGSC＠SiO2的荧光强度，lgC为Fe3+浓度的对数。重复测定3次以上，200 μmol/L Fe3+的相对标准偏差(RSD)为2.18%，检出限为25.12 μmol/L。因此，本文构建的荧光传感体系可用于Fe3+的检测。

图8 (a)与不同浓度Fe3+溶液混合后ZGSC＠SiO2的发射光谱；(b)检测Fe3+的标准曲线。Fig.8 (a)Fluorescence emission spectra of ZGSC＠ SiO2in the presence of Fe3+with different concentration.(b)Relationship between the fluorescence intensity of ZGSC＠SiO2and concentration of Fe3+.

3.5 实际样品的测定

为验证采用长余辉材料ZGSC＠SiO2用于检测Fe3+含量的可行性，本文选用了市面上3种常见市售补铁口服液作为实际样品，样品为1种乳酸亚铁口服液和2种钙铁锌口服液。分别测定了与不同实际样品混合之后，ZGSC＠SiO2的稳态发射光谱以及关闭激发光源后I＝I0/e(取300 μs)时的时间分辨光谱，结果如图9(a)、(b)所示。从图9(a)、(b)中可看出，随着样品中Fe3+的浓度增加，ZGSC＠SiO2的荧光猝灭程度均逐渐增大。分别对两种光谱的信噪比进行计算，稳态下的信噪比为5.3，时间分辨光谱中的信噪比为33.4，说明采用时间分辨技术检测铁含量的信噪比明显提高。通过图9(a)与(b)的对比可看出，时间分辨光谱有效地消除了背景干扰，实现了免实时激发检测。

图9 (a)加入不同样品时的ZGSC＠SiO2的稳态发射光谱；(b)与不同样品混合后的ZGSC＠SiO2的时间分辨光谱。Fig.9 (a)Emission spectra of ZGSC＠ SiO2in different samples.(b)Time-resolved spectra of ZGSC＠SiO2 in different samples.

为了验证所构建的传感体系的实用性，本研究利用ZGSC＠SiO2/Fe3+传感体系检测了3种实际样品中的总铁含量和Fe3+含量，并进行了加标实验。实验结果如表1、表2所示。表1为实际样品中的总铁含量和Fe3+含量的测定结果。从表1中可看出，本方法测得的实际样品中总铁含量与标注的总铁含量较为相符，且实验结果表明实际样品中Fe3+的含量较高，均大于总铁含量的60%。实际样品中总铁含量的RSD为2.416%～3.808%，Fe3+含量的RSD为3.263%～4.296%。实验结果证明，采用本研究构建的荧光探针检测实际样品中Fe3+含量具有良好的重现性。

对实际样品中的总铁含量以及Fe3+含量分别进行了加标实验，实验结果如表2所示。从表2中可看出，3种实际样品中总铁含量的平均加标回收率为99.00%～99.79%，Fe3+含量的平均加标回收率为99.90%～102.69%，测定结果符合测定要求，说明采用ZGSC＠SiO2/Fe3+传感体系检测Fe3+的含量是可行的。除此之外，还可根据所测得的总铁含量以及Fe3+的含量计算出实际样品中的有效组分Fe2+含量，且实际样品中Fe2+的含量较少，因此可说明在补铁口服液的生产、运输及储存过程中，Fe2+被大量氧化成Fe3+。可见本方法也可用于补铁口服液中有效价态Fe2+的质量控制检测。

通常大多数采用荧光分析法检测Fe3+都需要实时激发，而常见的补铁口服液的成分较为复杂，测定时存在强本底干扰，无法避免激发光和自体荧光的干扰[8]。与常见的补铁试剂中Fe3+含量的检测方法相比，本方法的优势是可同时检测Fe3+和Fe2+含量，操作简单，简化了前处理过程。并且由于长余辉材料具有独特的余辉性能，可采用时间分辨技术实现免实时激发检测，避免激发光造成的干扰，对于成分复杂的补铁药品采用时间分辨技术可有效避免其本底干扰，有利于补铁药品中铁含量的检测。

表1 样品中总铁含量和Fe3+含量的测定结果Tab.1 Determination results of total iron content and Fe3+in the samples

表2 样品中总铁含量和Fe3+含量加标回收的测定结果Tab.2 Recovery test results of total iron content and Fe3+in the sample

4 结 论

本研究采用水热法合成了纳米级的近红外长余辉材料 ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+，并对其进行了表面包硅处理得到ZGSC＠SiO2，有效提高了长余辉材料在水中的分散性。对长余辉材料的晶体结构和余辉性能进行表征分析，考察了其余辉特性。基于Fe3+可使长余辉材料ZGSC＠SiO2发生荧光猝灭现象，本文构建了新型荧光传感体系用于Fe3+含量的检测，并实现了对3种补铁口服液样品中总铁含量的检测以及Fe3+含量的检测。与其他检测方法相比，本方法可通过测定实际样品中的总铁含量以及Fe3+含量，实现Fe3+与Fe2+的同时检测，可应用于补铁口服液中有效价态Fe2+的质量控制。本方法具有信噪比高、无背景干扰、操作简便等优点。并且采用时间分辨技术测定实际样品中的铁含量，有效地避免了激发光的背景干扰以及复杂样品中的本底干扰，在保健品及复杂的生物样品中铁含量的检测方面都具有广泛的应用前景。