刘胜贵，马海悦*，李智高，付彬彬，孔令羽

（云南绿新生物药业有限公司，云南 曲靖 655000）

工业大麻为一年生草本植物，又名大麻、汉麻、火麻[1]，是指种子、茎、花梢（开花结果的梢）、花、叶及根部中的四氢大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻属植物。2003年1月，云南省公安厅制定了《云南省工业用大麻管理暂行规定》，规定四氢大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻品种为允许种植的工业大麻。主要应用于食品、制药、纺织、化妆品等行业，具有重大的潜在社会和经济价值[2-4]。

大麻素是大麻中特有的萜类次生代谢产物，目前报道的大麻素就有120多种，主要聚集在大麻植株的腺体毛中（主要在苞叶与嫩叶部位），最主要且含量较高的是大麻二酚（以下简称CBD） 和四氢大麻酚 (以下简称 THC）[4-5]。THC是大麻致幻物质的主要成分，也是导致许多国家禁种大麻的原因；CBD则能阻碍THC对人体神经系统影响，有“反毒品化合物”的美称[4-6]。CBD具有抗炎、抗惊厥、免疫调节、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用，在治疗癫痫、多种癌症、多发性动脉硬化与帕金森病、预防心肌梗死、抑制神经胶质瘤细胞转移和抑制性激素分泌等具有一定疗效。目前CBD已被FDA批准用于治疗难治性癫痫，是近年来的研究热点[5、7-8]。

目前，CBD主要来源于工业大麻，主要从工业大麻花苞及嫩叶中提取，CBD含量是评价工业大麻质量的重要指标，故准确测定工业大麻花叶原料中的CBD含量十分重要。尽管种植的是工业大麻品种，仍需关注THC的含量，这对大麻毒品的监测和控制有重要意义。目前，国内外关于CBD与THC的检测主要利用HPLC、GC-MS、LC-MS等，为此，本文研究参考相关文献[3、8-12]，建立了一种HPLC检测方法，用于测定工业大麻花叶中CBD和THC的含量，具有准确、稳定等特点，可用于工业大麻的品质判定，对工业大麻质量控制具有重要意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

样品：工业大麻花叶样品，置于鼓风干燥箱干燥至恒重（水分小于5%），粉碎（细度≤0.425mm），混匀置于自封袋中保存，待测。（样品来源：公司内部样品，本公司具备《云南省工业大麻种植许可证》）

仪器：Agilent 1260高液相色谱仪（包括G7111A四元泵，G7127A自动进样器，G7116A柱温箱，G7115A二极管阵列检测器，OpenLab CDS2色谱工作站，美国Agilent公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱 （150 mm×4.6 mm，5μm，美国 Agilent公司）；电子天平（FA1004B型，上海市安亭电子仪器厂）；超声波清洗器（G-100S，深圳市歌能清洗设备有限公司）；旋转蒸发仪（RE52-99，上海亚荣生化仪器厂）；纯水仪（Master-S15/30UVF型，上海和泰仪器有限公司）；0.22μm有机相微孔针筒过滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

试剂：甲醇（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；水为自制超纯水。四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD） 标准品（1mg/mL，1mL，美国Sigma-Aldrich公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工作曲线制作

将CBD及 THC标准物质 （1mg/mL，1mL）分别转移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，得100μg/mL的CBD或THC标准溶液，移取一定量100μg/mL CBD或THC母液，逐级稀释用甲醇定容，分别得CBD和THC浓度范围约为1～100μg/mL系列标准工作溶液。

1.2.2 样品分析

称取1g工业大麻花叶样品于锥形瓶中，加入10mL甲醇，超声提取30 min，然后过滤收集滤液，滤渣再用10mL甲醇超声提取两次，合并三次滤液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，然后将浓缩液转移至10mL容量瓶，用甲醇定容，经0.22μm滤膜过滤后，进HPLC分析。若样品处理液浓度超过标准工作曲线浓度范围，则稀释后再检测。

HPLC条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；流速：1mL/min，流动相A为水，流动相B为乙腈，等度洗脱， V（乙腈）：V（水） =65∶35；柱温：30℃；进样体积10 μL；检测波长220nm。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

本试验选择了甲醇、乙醇、正己烷+乙酸乙酯（9+1）为提取溶剂，取同一个样品，分别用不同溶剂提取，其余按本方法进行分析，采用样品中CBD及THC的含量进行样品提取评价，结果如表1。结果显示，用正己烷+乙酸乙酯作为提取溶剂时，样品中在THC标品出峰处未出峰，未检出THC。但用甲醇和乙醇提取时均能够检出THC，故不使用正己烷+乙酸乙酯（9+1） 作为提取溶剂；甲醇和乙醇相比甲醇溶液提取效率最好。因此，本方法选择甲醇作为提取溶液。

2.2 提取次数的选择

充分提取目标物是定量分析中的重要因素，本实验考察了提取次数对CBD和THC含量的影响。用甲醇提取四次，每次的提物液分别定容后进HPLC分析，其余按本方法进行处理，结果如表2。结果显示，随着提取次数的增加，CBD和THC的含量逐次减小，第四次的提取液中CBD和THC的含量均已非常低，可忽略，说明三次提取能够充分将工业大麻花叶的CBD和THC成分提取，故本实验选择用甲醇提取三次。

表1 不同提取溶剂对CBD和THC提取效果的影响Tab.1 effects of different solvents on extraction of CBD and THC

表2 不同提取次数对CBD和THC提取效果的影响Tab.2 effects of different extraction times on extraction of CBD and THC

2.3 标准曲线、检出限

按照1.2.1制作工作曲线，分别得CBD和THC浓度范围为1～100μg/mL系列标准工作溶液，进行HPLC分析。以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应标准浓度进行回归分析，得到标准曲线；以EPA方法计算方法的检出限（LOD），结果见表3。可见，在1～100μg/mL范围内线性好，R2＞0.9997。CBD、THC标准品谱图见图1、图2。

表3 方法线性回归方程、相关系数、检出限Table 3 linear regression equation,Correlation Coefficient,detection limit

2.4 精密度实验

取工业大麻花叶样品，用本实验方法进行测定，做6个平行样品，以评价本方法的精密度。结果见表4。结果表明，CBD和THC的相对标准偏差（RSD） 均小于3%。表明本方法可靠稳定，重复性好。

2.5 回收率实验

图1 CBD标准品HPLC色谱图Fig.1 HPLC CHROMATOGRAM OF CBD Standard substance

图2 THC标准品HPLC色谱图Fig.2 HPLC CHROMATOGRAM OF THC standard substance

表4 精密度实验结果（n=6）Tab.4 precision test results（n=6）

分别加入高、中、低 （2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL） 三个质量浓度水平的CBD和THC标准品溶液于空白样品（不含CBD和THC的样品）中，用本实验方法进行测定，求得CBD和THC的回收率，结果见表 5。回收率为82.0%～102.8%，表明本方法回收率好，准确可靠。

表5 回收率实验结果Tab.5 experimental results of recovery rate

2.6 样品分析

按本试验方法对3个工业大麻花叶样品进行分析，结果见表6。样品典型色谱图（见图3）。

3 结论

本方法采用HPLC同时测定工业大麻花叶中的 CBD和 THC，CBD的检出限为 0.12μg/mL，THC的检出限为0.08μg/mL，回收率在82.0%～102.8%，相对标准偏差（RSD）≤2.64%，可满足工业大麻花叶中CBD和THC的准确测定。

表6 样品分析结果Tab.6 results of sample analysis

图3 工业大麻花叶典型样品色谱图Fig.3 chromatogram of typical samples of industrial hemp flowers and leaves