姜辰昊 高增明 王 伟 孙天颖 余世锋 王存堂

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，齐齐哈尔 161006)

玉米淀粉是可利用的最廉价的淀粉，因其具有较好的流变和凝胶特性，通常在糊化后被用作增稠剂、黏合剂、稳定剂等[1, 2]。然而糊化后的淀粉在降温过程中易发生回生现象，导致淀粉类产品在存储期间出现硬度增加、黏度降低、抗酸解、脱水等回生现象，促使其品质变劣、货架期缩短[3]。因此在工业上，淀粉要经过各种物理或化学改性以防止回生。物理改性法主要包括湿热处理、挤压、微波和高静水压处理等方法，然而这些物理方法一般成本较高，不适宜大规模应用；化学修饰法主要包括对淀粉进行乙酰化、琥珀酰化以及磷酸化等方法，但是许多用于食品的化学修饰对人体健康不够安全[4]。因此，研究大多采用抗淀粉回生的食品添加剂，如黄原胶、环糊精、海藻酸钠，与淀粉溶液混合其亲水性端插入直链淀粉分子形成螺旋配合体，影响淀粉分子重排微环境，从而延缓淀粉重结晶，达到抑制回生的目的[3-5]。在淀粉糊化的过程中，小分子糖能够随水渗透并进入淀粉内部，达到抑制淀粉回生的目的[6]。此外，将原花青素、茶多酚等多酚类物质添加到淀粉中，也可有效抑制回生作用，其原因可能是淀粉和酚类化合物的羟基形成氢键，从而干扰贮存过程中淀粉多聚物链自身的结合所致[7, 8]。

洋葱中多酚类物质含量极为丰富，其成分主要是黄酮类、黄酮醇类和花色素类等[9]。洋葱外皮中黄酮类物质含量远远高于内部鳞茎，并且洋葱皮乙醇提取物可达10%[10, 11]。目前对洋葱黄酮类物质的研究集中在抗氧化成分结构鉴定、抗氧化活性、抗菌活性评价以及抗慢性退行性疾病方面。已有研究表明含有多羟基结构的茶多酚、原花青素对玉米淀粉的回生过程有显著的抑制效果，然而洋葱皮中黄酮类物质作为洋葱提取物中的主要生物活性成分，也是含有多羟基结构的黄酮类成分，其提取物对淀粉回生的影响研究鲜见报道。因此，本实验研究EEOS对玉米淀粉回生的影响，采用差示扫描量热仪、傅里叶红外光谱仪、X-射线衍射和扫描电镜探究EEOS与玉米淀粉的相互作用，并研究EEOS对淀粉体外消化性的影响，分析EEOS对玉米淀粉回生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫色洋葱外皮：齐齐哈尔农贸市场；玉米淀粉：市售；α淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(100 000U/g)；无水醋酸钠、冰醋酸、3，5二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、重苯酚、氢氧化钠、亚硫酸钠均为分析纯。

2.5L freezePrysystem真空冷冻干燥机；STA449F3 同步热分析仪；Specdrum-100红外光谱仪；Ultima IV型 X射线衍射仪；S-3400扫描电子显微镜。

1.2 方法

1.2.1 洋葱皮乙醇提取物(EEOS)的制备

称取洋葱皮300 g进行粉碎，加入600 mL，70%乙醇浸提2 h后，过滤取滤液。将滤渣再次进行上述提取过程，合并两次滤液。将滤液在50 ℃真空旋转蒸发，之后经冷冻干燥后的粉末即EEOS，将EEOS在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 淀粉样品的制备

取玉米淀粉 10 g，分别加 入 0%、2.5%、5%、10%的EEOS混合, 加水配制淀粉质量分数为50%样品，在121 ℃下糊化20 min。将糊化后样品放入4 ℃冰箱内分别贮存 0、5、10、15 d后，将样品冻干后研磨，过120目筛后，备用。

1.2.3 回生玉米淀粉的热力学性质测定

采用差式扫描量热仪(DSC)对回生玉米淀粉的热力学性质进行测定[12]。在使用DSC前，用标准铟进行校准。取2～3 mg样品放在铝制坩埚中，用微量进样器加入4～6 μL的蒸馏水后压样并平衡24 h，以空坩埚做对照，升温范围为20～200 ℃，载气为氮气，从DSC熔融曲线中读取起始温度T0，峰值温度Tp，及终止温度Tc。通过Origin 8.5软件进行积分计算各个样品的糊化焓值。

1.2.4 回生玉米淀粉的红外光谱测定[13]

采用傅里叶红外光谱仪对回生15 d的玉米淀粉样品进行测定。准确称取1 mg 样品与150 mg KBr 进行混合，充分研磨压片制样，进行红外光谱扫描，测量范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为16次，分辨率4 cm-1。

1.2.5 回生玉米淀粉XRD射线衍射的测定[14]

采用全自动X射线衍射仪对回生15 d的玉米淀粉进行晶型进行扫描，采用铜靶测定，条件为：电压40 kV，衍射角的旋转范围为5°～30°，扫描速度为2.0(°)/min，步长0.02°，结果用Origin 8.5进行积分计算相对结晶度。

1.2.6 回生玉米淀粉颗粒电镜扫描

对回生15 d的玉米淀粉样品进行电镜扫描。扫描电压 10.00 kV，电流 64.0 μA。将不同的样品做好记录，平稳地固定于直径1.0 cm的样品台上，喷金镀膜，在扫描电子显微镜下，分别用800、10 000的放大倍数从不同角度进行观察拍照[15]。

1.2.7 回生玉米淀粉体外消化能力测定[16]

混合酶液的配制：称取糖化酶(100 000 U/g)2 g和α淀粉酶溶液(20 000 U/mL)5 mL同时溶于100 mL蒸馏水中离心取上清液即为混合酶液。

称取淀粉样品100 mg，加入pH5.2的醋酸缓冲溶液25 mL，37 ℃水浴5 min，加入5 mL预热好的混合酶溶液，在540 nm下测20 min和120 min吸光度值，以葡萄糖为标准品，做标准曲线，方程式为y=1.613 4x-0.083 2，R2=0.999 1，根据葡萄糖标准曲线计算淀粉在20 min和120 min生成还原糖的含量[16]。

快消化淀粉(RDS)=[(G20-FG)/TS]×0.9×100%

慢消化淀粉(SDS)=[(G120-G20)/TS]×0.9×100%

抗性淀粉(RS)=[(TS-G120)/TS]×0.9×100%

式中：G20为酶水解20 min后产生的葡萄糖质量/mg；FG为酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖质量/mg；G120为酶水解120 min后产生的葡萄糖质量/mg；TS为样品中总淀粉含量。

1.2.8 数据统计

所得数据均为3次重复实验的平均值，所有实验结果均表示为平均值±标准偏差。采用SPSS11.0软件对所有数据进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性分析和相关性分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 EEOS对玉米淀粉的热力学性质的影响

淀粉的熔融焓值(ΔH)代表在与水共热的条件下，解开淀粉分子中双螺旋结构能量的大小，其本质是亲水性的羟基基团与支链淀粉的侧链相互作用，并在不同程度上结合到淀粉颗粒的无定形区域，从而改变结晶区和无定形基质之间的耦合力[16]。由表1可知，随着回生时间的延长，ΔH逐渐增加；且EEOS的添加对玉米淀粉的ΔH的影响是显著的，且随着浓度的增加玉米淀粉的ΔH呈现先下降后上升的趋势。添加EEOS的添加量为2.5%，在回生5 d后，玉米淀粉的ΔH比对照组降低了29.77%，抑制回生的效果最好。这可能是因为黄酮类物质的多-OH 结构有关，-OH 具有很强的亲水性可以与淀粉的侧链结合，不同程度键合到淀粉的无定形区域，致使淀粉糊化时ΔH降低。而添加 10% EEOS，玉米淀粉回生5 d后，其ΔH仅下降了15.26%，这可能是由于EEOS与玉米淀粉结合进一步增强，形成稳定的聚集结构，导致回生过程淀粉结构转变所需能量增多。此外还需指出的是，采用乙醇作为提取溶剂，其提取物中乙醇的残留，也可作为羟基的供体，参与淀粉的回生抑制过程。在乙醇提取过程中的旋转蒸发操作，导致提取物中的乙醇含量较低，其所含有的羟基对淀粉回生效果的抑制可能会很小，因此在研究中，尽量降低乙醇的残留量，减少对实验结果的影响。

表1 不同浓度的EEOS对回生玉米淀粉的热力学性质的影响

注：结果表示为平均值±标准偏差(n=3), 同一列中字母不同表示差异显著(P<0.05)，余同。

2.2 EEOS对玉米淀粉红外光谱的影响

将糊化后的淀粉储存在较低的温度下，由于其处于热力学不稳定状态，无序的支链淀粉链重新定向排列、内部水分逐渐丧失，从无序结构转变为有序结构，且分子间结构越有序，淀粉回生程度越大[17]。Goodfellow 等[18]通过对淀粉结构分析指出可以用红外光谱 800～1 200 cm-1之间吸光度比值表征淀粉的短程有序性，其中1 022 cm-1处与淀粉无定形区域相关，而 1 047 cm-1与淀粉有序程度相关。Flores 等[19]用吸收峰1 047/1 022 处吸光度比值来确定结晶区域的有序性，因此1 047/1 022吸光度的比值可以代表淀粉回生程度的大小。EEOS对玉米淀粉回生性质影响的红外光谱如图1所示。

图1 EEOS添加量对玉米淀粉红外光谱的影响(回生15d)

从表2可知，在添加不同浓度EEOS时，回生15 d的玉米淀粉在1 047/1 022处表征的吸光度值均有所下降，表明EEOS可抑制玉米淀粉的回生。而添加2.5%的EEOS玉米淀粉1 047/1 022吸光度的比值与对照组相比，下降了约6.31%，说明添加2.5%的EEOS对玉米淀粉回生有较好的抑制效果。

表2 EEOS添加量对1 047/1 022比值的影响(回生15 d)

2.3 EEOS对玉米淀粉重结晶情况的影响

淀粉的回生过程是糊化的可逆过程，糊化后的淀粉分子在低温下自动排列成序，相邻分子间的氢键又逐步恢复形成致密、高度晶化的分子微束[7]。在回生过程中，随着时间的延长，回生程度随之增大，结晶度也随之增加[17]。XRD 分析测定的是不同EEOS添加量时玉米淀粉样品在回生后的最终重结晶情况(图2)。而当淀粉回生后，16.9°处有很强的吸收峰，这是B-型结晶典型的特征[17]。当添加不同浓度的EEOS后，淀粉回生样品在16.9°处的衍射强度均有所下降，说明EEOS的添加可有效抑制玉米淀粉的的回生。这可能是由于黄酮类物质含有大量的羟基，可以通过非共价相互作用与直链淀粉或者支链淀粉的部

图2 EEOS添加量对回生玉米淀粉XRD射线 衍射图的影响(回生15 d)

分分支之间发生相互作用，限制了淀粉分子之间的重结晶，从而抑制淀粉的回生过程[20]。

此外，根据表3中淀粉相对结晶度的结果可以看出，添加不同浓度的EEOS的淀粉相对结晶度均有所下降。添加2.5%的EEOS的淀粉相对结晶度比对照组下降了2.95%，但是添加量增大到5%和10%时，回生淀粉样品的相对结晶度反而高于添加量为2.5%时的样品，说明EEOS的添加量对淀粉回生的抑制作用并没有浓度依赖关系，添加量为2.5%时可达到较好的抑制回生的效果。

表3 EEOS添加量对玉米淀粉相对结晶度的影响(回生15 d)

2.4 EEOS对回生玉米淀粉微观结构的影响

通过电镜扫描可以从微观层面观察EEOS对玉米淀粉颗粒表面结构所造成的影响，结果如图3所示。在回生15d后，对照组的玉米淀粉表面是不规则的粗糙多孔结构。而加入2.5%的EEOS的淀粉表面结构平整，粗糙度降低。这可能是由于冷藏条件下的回生玉米淀粉，在冷冻干燥时水分升华，对照组的不规则多孔结构就是由于孔洞内水分损失造成的。而添加EEOS的淀粉分子的羟基与提取物中的含有大量羟基的黄酮类物质的羟基形成氢键，从而在冷冻升华干燥后仍然能够保持较为光滑的表面形态[15]。

图3 EEOS对回生玉米淀粉微观结构的影响

2.5 EEOS对玉米淀粉体外消化的影响

根据在人体消化道内消化速率的差异，淀粉分为3类，快消化淀粉(RDS) 、慢消化淀粉(SDS) 和抗性淀粉(RS)。快消化淀粉指的是20 min内淀粉在体内生成还原糖的含量，慢消化淀粉指的是在120 min内淀粉在体内生成还原糖的含量，抗性淀粉指的是不能被淀粉酶水解的淀粉含量[21]。

表4 不同浓度的EEOS对回生淀粉的体外消化性质的影响

由表4可知，随着的回生时间的延长，玉米淀粉中RDS含量逐渐下降，SDS和RS含量逐渐增加，说明淀粉在4 ℃储存的过程中回生程度的增加也会导致消化性逐渐变差。EEOS添加量为2.5%和5%时，回生5 d 的玉米淀粉的RDS含量下降分别为21.36%和33.22%，但当EEOS添加量为10%时与添加量为5%相比，RDS含量差异不显著(P>0.05)。同时，与对照组相比，EEOS的添加，导致玉米淀粉中RS的含量显著增加(P<0.05)，添加量5%和10%的样品对比则没有显著差异(P>0.05)。这可能由于EEOS中的黄酮类物质含有较多的氢键，玉米淀粉颗粒表面被黄酮类成分的多羟基结构紧紧包围，减少了酶对淀粉消化作用的表面积[21]，从而阻止酶对淀粉的水解位点所致。同时，EEOS添加量10%时，并没有显著导致RDS含量的增加和RS含量的下降，也可能是因为EEOS的添加量为5%时已达到饱和效果，过量的添加对消化程度的抑制并不显著。韦冷云[22]也发现向淀粉中添加一定比例的菊糖，淀粉的水解率会有一定程度的降低。

3 结论

将EEOS(富含黄酮类物质)添加到玉米淀粉中，其回生焓值、相对结晶度、1 047/1 022的比值均显著降低，回生后的玉米淀粉微观结构发生改变，均说明EEOS对玉米淀粉的回生有抑制作用。EEOS的添加量对回生的抑制程度有显著影响，添加2.5%的对回生的抑制效果较好。此外，EEOS的添加，促使玉米淀粉的消化体外消化性能下降，RDS含量下降、RS含量增加。