王颢潜 肖芳 杨蕾 缪青梅 张旭冬 张秀杰

（1. 农业农村部科技发展中心，北京 100176；2. 中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062；3. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州 310021）

随着转基因生物技术的不断发展，全球转基因作物种植面积持续增长，已从1996 年的170 万hm2增加到2018 年的1.917 亿hm2，产生了巨大的社会效益和经济效益［1］。大力发展转基因生物技术，培育优良转基因品种已成为各国保障农业可持续发展的趋势。生物技术产业的健康发展，离不开健全的转基因生物安全监管制度。为了有效的监管转基因生物，保护消费者的知情权，包括我国在内的全球60 多个国家和地区相继颁布实施了转基因生物安全管理制度、标识管理制度以及配套的办法规定 等［2-3］。2001 年以来，我国先后颁布了《农业转基因生物安全管理条例》《农业转基因生物安全评价管理办法》《农业转基因生物进口安全管理办法》等配套规章制度，对农业转基因生物的试验研究、生产、加工、标识、进口等环节进行全过程严格管理。转基因生物安全的跟踪监管必须以有效的检测方法为基础。针对商业化生产或国内批准安全证书的转基因产品建立特异、灵敏、标准化的检测方法是落实转基因生物安全管理制度的重要保障，更是我国转基因生物安全监管工作的重要技术支撑。

据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，目前全球已批准商业化种植31 种转基因作物，共涉及517 种转化体，其中玉米转化体237 种，是获得商业化批准最多的转基因作物［4］。玉米作为中国重要的粮食及饲料作物之一，是国内转基因研发领域的重点。我国自2008 年启动实施转基因重大专项以来，自主基因、自主技术、自主品种的研发能力显著提升，研发出一批具有商业化应用前景的转基因作物品种。2020 年1 月21 日，农业农村部发布2019 年农业转基因生物安全证书（生产应用）批准清单，其中包括2 个玉米品种和1 个大豆品种。这是2009 年转基因抗虫水稻“华恢1 号”、“Bt 汕优63”和转基因植酸酶玉米“BVLA430101”获得转基因生物安全证书之后，又有主要农作物品种获批。特别是“十三五”国家科技创新规划提出“占领制高点、推进产业化”的战略目标，我国转基因玉米产业化进程将进一步加快，加之申请进口安全证书的国外转基因产品也越来越多，我国转基因生物安全监管的任务也将越来越重，对于转基因检测方法的要求也越来越高。

抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5（瑞丰125）是本次获批的玉米品种之一，该品种由浙江大学采用农杆菌介导方法转化而成，转入独立发掘的抗虫基因和耐草甘膦基因，表现出良好的抗虫性和除草剂（农达）耐受性，具有广阔的应用前景。未来，转基因玉米双抗12-5 的成功推广和应用，离不开有效的转基因安全监管。为此，我们组织了8 家实验室：吉林省农科院（编号1）、山东省农科院（编号2）、浙江省农科院（编号3）、中国农科院植保所（编号4）、中国农科院生物所（编号5）、中国农科院棉花所（编号6）、农业农村部天津环保所（编号7）、天津市农科院（编号8），对研发单位提供的转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性和定量PCR 方法进行了实验室间验证，并参照农业部2259 号公告-4-2015［4］、农业部2259 号公告-5-2015［5］及专家认定的验证方案对检测方法进行评价与分析，为后续标准方法的建立和转基因生物安全监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性、定量PCR 方法循环验证所涉及的共13 种样品（包括7 种单一组分样品、6 种混合样品，见表1）。其中，涉及定性PCR 方法的有10 种样品，涉及定量PCR 方法的有12 种样品，阳性对照、阴性对照和特异性检测样品在定性和定量PCR 检测方法验证中共用。以上样品均由农业农村部科技发展中心统一提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 参照《转基因植物及其产品成分检测DNA 提取和纯化》（农业部1485 号公告-4-2010）［6］执行。每个样品提2 份DNA，每份DNA 做3 次平行。将所有样品研磨成粉末，按照植物基因组DNA 提取试剂盒操作说明书，提取样品基因组DNA，使用紫外分光光度计对DNA 样品浓度和纯度进行测定，确认OD260/280比值在1.7-2.0 之间，再用0.1×TE 缓冲液将纯化的DNA 溶液稀释至终浓度25 ng/μL，4℃冷藏保存备用。

1.2.2 引物设计 根据双抗12-5 研发单位提供的技术资料，转化体特异性定性PCR 引物为：F ：5′-CAACGTCGTGACTGGGAAAA-3′，R ：5′-TGGAAGACAAGTTCTACGGGCT-3′， 扩 增 产物大小为256 bp。转化体特异性定量PCR 引物为：F ：5′-GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3′，R ：5′-GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA-3′，P：FAMAGCTCAACCACATCGCCCGACGC-BHQ1，扩增产物大小为94 bp。定性PCR 和定量PCR 引物位置见图1。

表1 样品信息表

图1 定性PCR 和定量PCR 引物位置示意图

1.2.3 定性PCR 反应 根据双抗12-5 研发单位提供的技术资料，定性PCR 反应程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35 次循环；72℃延伸7 min。定性PCR 反应体系见表2。

1.2.4 定量PCR 反应 根据双抗12-5 研发单位提供的技术资料，定量PCR 反应程序为：95℃变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，共进行50 次循环；在第二阶段的退火延伸（60℃）时段收集荧光信号。定量PCR 反应体系见表3。

表2 双抗12-5 转化体特异性定性PCR 检测反应体系

表3 双抗12-5 转化体特异性定量PCR 检测反应体系

1.2.5 建立标准曲线 提取双抗12-5 样品中的基因组DNA，用0.1×TE 缓冲液按照1∶5 稀释成5 个拷贝数梯度为3.6×104、7.2×103、1.44×103、2.8×102和5.7×101的标准溶液，分别进行zSSIIb内标准基因和双抗12-5 转化体的实时荧光定量PCR，每个梯度设置3 个平行。以模板拷贝数的对数值为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立双抗12-5 和zSSIIb内标准基因的标准曲线，并得到标准曲线公式：（n：模板拷贝数，y：测试样品的Ct 值，a：标准曲线的斜率，b：标准曲线的截距）。实时荧光定量PCR 体系及程序见1.2.3，玉米内标基因zSSIIb的引物为：zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′，zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′，zSSIIb-P：FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTGBHQ1，扩增产物大小为88 bp。

1.2.6 定量PCR 方法准确性测试 对质量分数为5%和0.5%的准确性样品分别进行定量PCR，每个样品做3 次平行，重复2 次试验。根据测定出的Ct 值，按照标准曲线公式计算出式样中双抗12-5 转化体和zSSIIb内标基因的模板拷贝数，再根据下面公式［7］计算样品中转基因成分的含量：

2 结果

2.1 定性PCR方法循环验证结果

按照上述定性PCR 反应体系，用双抗12-5 转化体特异性定性引物扩增相应的待测样品。经8 家实验室验证结果显示，在定性PCR 方法特异性检测中，所有实验室均从含有双抗12-5 样品中扩增出其转化体特异性序列，且片段大小与预期一致，在其他转基因玉米混样、转基因大豆混样、转基因棉花混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、非转基因玉米混样和阴性样品中均未扩增出双抗12-5 转化体特异性序列；在灵敏度检测中，所有实验室均从质量分数为0.1%的双抗12-5 样品中扩增出其转化体特异性序列，且片段大小与预期一致，以3 号实验室的结果为例，见图2。8 家实验室具体验证结果见表4。综上说明，研发单位提供的转基因玉米双抗12-5转化体特异性定性PCR方法具有良好的特异性，检测灵敏度达到0.1%。

图2 转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性PCR 方法的灵敏度检测

表4 转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性PCR 方法验证结果汇总表

2.2 实时荧光定量PCR方法循环验证结果

2.2.1 特异性及灵敏度检测 按照上述定量PCR 反应体系，用双抗12-5 转化体特异性定量引物扩增相应的待测样品。由于第4 家实验室空白对照中有明显的扩增信号，将该实验室验证结果列为异常数据剔除。在定量PCR 方法特异性检测中，7 家实验室均从含双抗12-5玉米转化体的样品中获得扩增信号，而在其他转基因玉米混样、转基因大豆混样、转基因棉花混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、非转基因玉米混样和阴性样品中均未获得扩增信号；在灵敏度检测中，7 家实验室均从质量分数为0.05%的双抗12-5 样品中获得扩增信号。8 家实验室具体验证结果见表5。

表5 转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定量PCR 方法验证结果汇总表

综上说明，研发单位提供的转基因玉米双抗12-5 转化体特异性实时荧光定量PCR 检测方法具有良好的特异性，检测灵敏度达到0.05%。

2.2.2 标准曲线的建立及扩增效率测试 对8 家实验室建立的双抗12-5 转化体和zSSIIb内标基因的标准曲线数据汇总分析，具体如下：内标基因zSSIIb的标准曲线斜率范围在-3.572--3.128 之间，平均值为-3.309。根据斜率计算的PCR 扩增效率为90.55%-108.75%之间，平均值为100.94%，符合农业部标准［5］中大于90%和小于110%的要求。决定系数R2值均大于0.98，平均值为0.996，符合农业部标准［5］中大于0.98 的要求；双抗12-5 转化体的标准曲线斜率范围在-3.569-3.127 之间，平均值为-3.372。根据斜率计算的PCR 扩增效率为90.65%-108.85%之间，平均值为98.36%，符合农业部标准［5］大于90%和小于110%的要求。决定系数R2值均大于0.98，平均值为0.996，符合农业部标准［5］大于0.98 的要求。具体数据见表6。

表6 玉米内标基因zSSIIb 和双抗12-5 的扩增效率及标准曲线决定系数

综上，8 家实验室的双抗12-5 转化体和zSSIIb内标基因检测体系的扩增Ct 值与模板拷贝数间均存在良好的线性关系，所建立的标准曲线均可用于定量PCR 结果分析。

2.2.3 准确性测试 将8 家实验室提供的数据和结果进行汇总分析，采用科克伦（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法对测试结果进行异常值检验，在实验室数量为8、置信区间为5%的条件下，科克伦检验和格拉布斯检验的临界值分别为：0.680 和2.126［8］，分别计算8 家实验室的科克伦统计量C 值和格拉布斯统计量G 值［8］。经计算，5%质量分数样品中1 号实验室的G 值和6 号实验室的C 值大于临界值，为2 组异常值，0.5%质量分数样品无异常值。剔除异常值后，计算出每个实验室2 份准确性样品的测量平均值，得出测量值与真值的偏差（Bias），6 家实验室5%样品测试值与真值的偏差的范围在-8.30%-0.40%之间，8 家实验室0.5%样品测试值与真值的偏差的范围在-10.0%-62.0%之间（见图3）。综合8 家实验室中的有效数据计算5%和0.5%准确性样品的测量平均值分别为4.88%和0.61%，偏差分别为2.47%和21.38%，大多数的偏差主要是正值，具体数据见表7。质量分数为5%和0.5%的双抗12-5 样品的偏差小于25%。验证结果表明，双抗12-5 定量方法能准确地定量检测质量分数为5%和0.5%的双抗12-5 样品。

图3 8 家实验室测量值与真值相对偏差示意图

2.2.4 重复性和再现性 根据剔除异常值后的准确性样品测试结果，计算8 家实验室内重复性相对标准偏差（RSDr值）和实验室间再现性的相对标准偏差（RSDR值），见表8。8 家实验室定量检测质量分数为5%、0.5%双抗12-5 样品的RSDr值均介于1.13%-20.20%之间，符合农业部标准中RSDr ≤ 25%的要求［5］，说明该方法在实验室内具有良好的重复性；8 家实验室定量检测质量分数为5%、0.5% 双抗12-5 样品的RSDR值分别为4.52%、18.43%，符合农业部标准中RSDR≤ 35%的要求［5］，说明该方法在实验室间具有良好的再现性。

3 讨论

目前，转基因产品的检测方法主要分为两类：基于外源核酸的检测技术和基于外源蛋白的检测技术［9］。由于核酸在提取、保存及稳定性方面的优势，使得基于核酸的检测方法在转基因产品检测中得到快速发展。根据检测靶标的不同，基于核酸的检测方法分为筛查检测、基因特异性、构建特异性检测和转化体特异性检测4 种类型［10］。转化体特异性检测方法以外源插入序列与植物基因组的连接区为检测靶标，不仅能检出转入基因序列，还可判定待测样品的转基因作物品系，具有高度特异性，是国内外转基因产品检测标准建立的主要方法［11-12］。基于核酸的检测方法有普通定性PCR、实时荧光定量PCR、多重复合PCR［13］、数字PCR［14］、重组聚合酶扩增（RPA）［15］、环介导等温扩增技术PCR 方法［16］等，其中定性PCR、实时荧光定量PCR 应用最为广泛［17］。中国的转基因产品检测标准以定性PCR 方法为主，而欧盟联合实验室则以实时荧光定量PCR 方法为主［18］。定性PCR 操作相对简单，仪器和试剂成本较低，但是相应的分辨率低，只可以做定性判断。实时荧光定量PCR 相对准确灵敏，不仅可以定性，而且可以判断转基因成分准确含量，但仪器和成本大幅提高，且需要制备标准品。

表7 准确性样品的测试结果

表8 RSDr 值和RSDr 值计算结果

本研究对2020 年获得安全证书的转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性、定量PCR 方法进行验证和评价。双抗12-5 转化体特异性定性PCR 方法从特异性和灵敏度等指标进行验证，结果显示，该方法能从含有双抗12-5 的样品中特异性地检测出预期片段，而在Bt11 等19 种其他转基因玉米混合样、GTS40-3-2 等14 种转基因大豆混合样、TT51-1 等8种转基因水稻混样、MON1445 等7 种转基因棉花混样、MS1 等10 种转基因油菜混样中未检出双抗12-5转化体成分，有效区别其他常见转基因品种，未出现假阳性和非特异性条带，具有高度特异性，检测灵敏度可以稳定达到0.1%，而且8 家实验室验证结果一致，表明方法有较好的实验室间再现性。

双抗12-5 转化体特异性定量PCR 方法从特异性、灵敏度、准确性、精密度等指标来进行验证和评价。验证结果显示，双抗12-5 转化体特异性定量PCR 具有高度特异性，且检测灵敏度可以稳定达到0.05%。准确性是评价方法的基本要求，我们对8 家实验室建立的标准曲线进行了分析，双抗12-5 的标准曲线斜率范围在-3.569--3.127 之间，扩增效率在90.65%-108.85%之间，R2值均大于0.98，说明模板的量和Ct 值有很好的相关性，均满足定量分析的要求［5］。采用科克伦（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法剔除异常值后，得出5%、0.5%准确性样品对应的测量平均值分别为4.88%、0.61%，偏差分别为2.47%、21.38%，表明双抗12-5 定量方法能准确地定量检测质量分数为5%和0.5%的样品，具有较好的准确性。精密度是用来表示测试结果之间的接近程度，精密度越高，说明各次测量数据比较接近［19］。RSDr 值和RSDR值是反映方法精密度的重要指标［8］。8 家实验室RSDr 值均介于1.13%-20.20%之间，两个准确性样品的RSDR值分别为4.52%、18.43%，精密度符合要求［5］，说明该方法具有良好的重复性和再现性。

4 结论

本研究组织了8 家实验室对我国新批准安全证书的转基因玉米双抗12-5 转化体特异性定性、定量PCR 方法进行了循环验证，验证结果表明定性与定量PCR 检测方法均具有稳定性好、特异性强和灵敏度高的特点，定量PCR 方法能精确地定量检测质量分数为5%和0.5%的双抗12-5 样品，并且具有良好的重复性和再现性。本研究有助于后续标准方法的建立和完善，为我国转基因生物安全监管提供技术支撑和决策依据。