陈祥娃，霍婷婷，董发勤，刘靳波，邓建军,3

(1.西南医科大学 附属医院，四川 泸州 646000； 2. 西南科技大学 固体废物处理与资源化教育部重点实验室，四川 绵阳 621010； 3. 四川绵阳四O四医院，四川 绵阳 621000)

近年来频发的区域性雾霾天气主要与高浓度的细颗粒物2.5(PM2.5)相关。有研究表明矿物粉尘是大气颗粒物的主要成分之一，如硅质矿物石英、硫酸盐矿物石膏及芒硝等(徐宗泽等, 2019)。杨洁等(2017)利用X射线衍射光谱仪检测到可吸入细颗粒物PM2.5中主要矿物成分为石英，并证实其能抑制细胞增殖，使细胞周期G2/M期阻滞。有研究报道，空气污染物与心血管疾病的发病率和死亡率有关(Newbyetal., 2015; Caietal., 2016)。鼻咽喉、气道和肺是大气中石英粉尘攻击人体的直接靶器官，流行病学研究已经表明，大气污染与呼吸道炎症发病率的增加和肺功能下降密切相关(Zhaoetal., 2019)。体内外实验也证实，大气颗粒物的急性暴露可诱导支气管高反应性(bronchial hyper reactivity, BHR)、气道炎症的发生，释放IL-6与IL-8等炎症因子，发挥其促进细胞增殖、诱导发热反应等生理学功能(Guoetal., 2017; Oginoetal., 2018)。 目前，大气颗粒物的细胞毒理效应所涉及的机制主要有氧化应激、炎症信号传导途径活化、DNA损伤和表观遗传学改变等(Liuetal., 2018; Yangetal., 2018; Wangetal., 2019; Lietal., 2019)，其中炎症信号转导途径的活化会诱导细胞产生高水平的炎症因子，使组织发生渗出、增生、变质、肉芽肿等病理变化，进而发展为肺部纤维化、自发性气胸、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)。Toll样受体4(toll like receptor,TLR4)信号途径在调控炎症反应、先天性免疫应答上起关键作用，其可被各种病原/危险相关分子模式激活，参与了各种炎症因子的产生过程。TLR4受体多分布在巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞膜表面，但其在石英粉尘致人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cells, 16HBE)炎症反应中的作用少有报道，故本研究采用16HBE细胞作为石英粉尘染毒对象，探讨石英粉尘对16HBE细胞炎症反应的机制，以期在分子生物学层面对其致气道炎症机制进行更深入的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

主要试剂有Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM, 含4mM L-谷氨酰胺)(Hyclone)、胰酶消化液、青链霉素双抗溶液(碧云天)、胎牛血清(Gibco)、CCK-8(cell counting kit-WST8)、Human IL-6 ELISA Kit、Human IL-8 ELISA Kit(BOSTER)、TAK-242(MCE)、全蛋白抽提试剂盒(凯基)和抗TLR4抗体(CST)。

主要仪器有X射线衍射光谱仪(X’pert PRO, PANalytical)、倒置相差荧光显微镜( Axio ObserverA1, Zeiss) 、全波长酶标仪 ( PowerWave XS2, BioTek)、蛋白电泳仪(Power Supplies Basic, Bio-rad)、凝胶成像系统(BOXChemiXR5, SYNGENE G)。

1.2 实验方法

1.2.1 石英粉尘物相分析

石英粉尘由西南科技大学固体废物处理与资源化教育部重点实验室提供，经卧式行星球磨机研磨、烘干后得到粒径≤2.5 μm的石英粉尘样本。采用X射线衍射光谱仪，利用Cu Ka辐射(k=1.541 78 Å)对样本进行物相鉴别。

石英粉尘样本经高压蒸汽灭菌处理后，溶解于DMEM基础培养基，超声震荡30 min配制为1 000 μg/mL的母液，并依次稀释至实验所需浓度。

1.2.2 细胞培养

人支气管上皮细胞来源于广州呼吸系统疾病研究所，细胞所用完全培养基含有90% DMEM，并添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%青链霉素双抗溶液(含100 U/mL的青霉素、0.1 mg/mL的链霉素)。将细胞培养于37℃、5%CO2的饱和湿度环境中。待细胞贴壁密度达80%～90%，消化细胞以1∶2的比例传代于T25 cm2培养瓶中。每次实验之前，要求细胞的贴壁密度达80%左右。

1.2.3 细胞相对存活率检测

使用DMEM完全培养基调整16HBE细胞悬液浓度为1.0×105/mL，以100 μL/孔的体积接种于96微孔板中，培养至细胞贴壁密度为80%左右，依次加入终浓度为0(对照)、25、50、75、100、125、150、175、200和250 μg/mL的石英粉尘悬液，每个浓度设置3个复孔。为消除颗粒物背景对于光密度(OD值)的影响，每个浓度都设置其对应的背景孔(仅含相应浓度的石英粉尘悬液)。染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，避光孵育1.5 h后于450 nm处测定每个孔的OD值，并按以下公式计算细胞相对存活率： 细胞相对存活率(%)=(OD实验孔-OD对应背景孔)/(OD对照孔-OD对应背景孔)×100%。

1.2.4 ELISA法检测染毒后细胞上清液中IL-6、IL-8浓度

调整细胞悬液浓度为1.0×105/mL，接种于6孔板中，培养至细胞贴壁密度为80%左右。依次加入终浓度为0(对照)、25、50、75、100 μg/mL的石英粉尘悬液，每个浓度做3个复孔。染毒24 h后取上清液，3 000 r/min、4℃离心5 min后收集上清液，1∶2稀释。按照试剂盒说明书进行实验。

1.2.5 Western Blot检测染毒后细胞裂解液中TLR4的表达情况

使用全蛋白抽提试剂盒提取各浓度石英粉尘悬液处理后的16HBE细胞裂解液中的总蛋白质，以15 μL/孔的上样量加入10%的分离胶上进行蛋白质分离，然后转移到硝酸纤维素薄膜(NC膜)上。将膜在5%脱脂奶粉中封闭1.5 h，尔后把膜置于含抗TLR4抗体(1∶1 000稀释)的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。之后吸取一抗，TBST缓冲液洗膜3次，用5%脱脂奶粉封闭液稀释二抗，室温摇床振荡反应1.5 h，滴加ECL发光工作液，并使用G:BOX chemiXR5系统获得蛋白条带图像，Gel-Pro32软件测量条带灰度值。

1.2.6 TLR4抑制剂预处理后细胞上清液中IL-6、IL-8的浓度检测

为了验证TLR4在气道炎症中的作用，将TAK 242(1 μg/mL，每孔2 mL)对细胞进行1 h的预处理，再依次加入终浓度为0、25、50、75、100 μg/mL的石英粉尘悬液，后续操作同1.2.4。

1.2.7 统计学分析

定量数据以“均数±标准差”的形式表示，联合Excel和SPSS17.0对其进行计算和差异性比较，在数据满足正态分布且方差齐的前提下，两组间样本均数的比较采用单因素方差分析，否则采用校正t检验(t’检验)。P<0.05 表示差异有统计学意义；P<0.01表示差异有显著统计学意义。所有图形使用GraphPad Prism 8.0和Origin 8.2.0进行绘制。

2 实验结果与数据分析

2.1 石英粉尘的XRD图谱

由石英粉尘的X射线衍射图谱(图1)可知，本次研究的大气颗粒物中主要物相为石英，并含有少量方解石。

图 1 石英粉尘的XRD衍射图Fig.1 XRD diffraction diagram of quartz dust

2.2 石英粉尘染毒后16HBE细胞存活率

不同浓度的石英粉尘悬液染毒16HBE细胞24 h后，细胞相对存活率的变化如图2所示。图中，*表示与对照组相比，P<0.05;**表示与对照组相比，P<0.01。与对照组相比,各个浓度的石英粉尘悬液都降低了细胞存活率。当浓度介于0～100 μg/mL时，细胞存活率维持在60%以上。浓度为200与250 μg/mL时，细胞存活率显著降低，分别为(52.43±3.99)%和(48.81±7.87)%。

2.3 石英粉尘及抑制剂处理后细胞IL-6与IL-8表达水平

与对照组相比，使用1 μg/mL的TAK 242处理16HBE细胞24 h未对细胞存活率造成影响(图3)。

图 2 石英粉尘对16HBE细胞相对存活率的影响Fig. 2 Effects of quartz dust on 16HBE cell relative survival ratio

图 3 抑制剂对16HBE细胞相对存活率的影响Fig. 3 Effects of inhibitor on 16HBE cell relative survival ratio

如图4所示，随着石英粉尘悬液浓度增加，细胞因子IL-6与IL-8的表达呈现递增趋势，当石英粉尘悬液浓度为100 μg/mL时，与对照组相比，IL-6浓度显著增加，为348.47±20.49 pg/mL(表1)。当悬液浓度为50、75、100 μg/mL时，IL-8浓度显著增加，分别为667.81±69.56、677.17±31.85 和844.63±37.32 pg/mL。 此外，用抑制剂TAK 242预处理1 h后，50、75、100 μg/mL浓度组的细胞因子IL-6与IL-8表达降低。 图4中，TAK 242(-)表示未使用该物质预处理细胞，仅使用了石英粉尘处理；TAK 242(+)表示使用1 μg/mL的TAK 242预处理细胞1 h再进行染毒实验；*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01；#表示与未使用抑制剂的相同石英粉尘浓度组相比，P<0.05；##表示与未使用抑制剂的相同石英粉尘浓度组相比，P<0.01。

图 4 石英粉尘及抑制剂处理后16HBE细胞IL-6与IL-8的相对表达Fig. 4 Relative expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells treated with quartz dust and inhibitor

表 1 石英粉尘和抑制剂对16 HBE细胞IL-6和IL-8表达的影响

Table 1 Effects of quartz dust and inhibitor on the expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells

石英粉尘浓度/(μg·mL-1)IL-6浓度/(pg·mL-1)IL-8浓度/(pg·mL-1)TAK 242(-)TAK 242(+)TAK 242(-)TAK 242(+)对照215.69±25.99200.14±13.50387.65±60.60355.75±10.1825266.25±8.21241.25±49.08570.98±42.86∗259.56±19.3150274.86±11.31∗185.97±0.96##667.81±69.56∗∗477.97±7.76#75300.69±41.97∗189.58±3.63#677.17±31.85∗∗470.67±28.46##100348.47±20.49∗∗226.53±30.69##844.63±37.32∗∗597.81±42.72##

2.4 石英粉尘处理后细胞TLR4表达水平

如图5所示，TLR4的表达量随石英粉尘悬液浓度增加而上调。相同浓度的石英粉尘染毒条件下，使用TAK 242预处理组较未使用组的TLR4表达量降低。经内参蛋白GAPDH校正后，与对照组相比，50～100 μg/mL浓度组的TLR4表达明显增加(P<0.01)，100 μg/mL组的TLR4表达为对照组的11.45倍，差异具有统计学意义。

图 5 石英粉尘和TAK 242对16HBE细胞TLR4表达的影响Fig. 5 Effects of quartz dust and TAK 242 on the expression of TLR4 in 16HBE cells

3 讨论

大气细颗粒物污染除造成雾霾天气、降低空气能见度外，已成为我国的一个重大公共卫生问题。经济发展过程中，建筑施工、渣土运输、工业化采矿、水泥(粉煤灰)制砖等都会造成大气细颗粒物浓度上升，当这些固体物质分散并悬浮在气体介质中便形成气溶胶，并可通过呼吸系统进入机体。大气细颗粒物因直径极小，吸入后易沉积在肺组织，甚至可以通过气-血屏障扩散进入血液，导致气道炎症和系统性炎症的发生。Huang等人搜集的流行病学数据表明，当大气颗粒物浓度大于38.98 μg/m3时，非吸烟健康人群对COPD的易感性增加(Huangetal.,2019)。大量体内外实验证实，暴露于高浓度的大气颗粒物环境下，会导致肺功能下降以及诱导变应性气道疾病、急性气道炎症、哮喘等疾病的发生(Zhouetal., 2016; Shenetal., 2018)。

炎症反应被认为是大气细颗粒物引发肺部损伤的基本病理过程。暴露于雾霾环境下可能导致健康人发生鼻腔炎症和超敏反应，鼻腔分泌物中NO、IL-5、IL-8、P物质、神经生长因子和血管活性肠肽的水平显著增加(Xianetal., 2019)。矿物是大气颗粒物的主要成分之一，本次实验结果显示，微米级石英粉尘颗粒染毒后会引起16HBE细胞上清液中IL-6与IL-8水平显著增加。IL-6已被确定为关键的免疫调节多肽类细胞因子，有促进细胞增殖、诱导发热反应的作用，是COPD患者的预后生物标志物(Wuetal., 2017)，其还被证明为上皮间充质转化的触发因素(Browningetal., 2018)。IL-8属于趋化因子家族的一员，主要功能为募集白细胞到炎症发生部位，并诱导其释放一系列生物活性产物引起组织损伤。研究发现，大气颗粒物染毒后的肺组织中有丰富的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润(Oginoetal., 2017； Xuetal., 2019)，本次研究检测到的高IL-8表达与此实验结果相符合。

高浓度炎症因子的表达与分泌由TLR4信号途径进行调控。TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，当配体与髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation-2,MD-2)结合，会导致TLR4二聚化，胞内区形成Toll白介1受体 (toll interleukin 1 receptor,TIR)结构域(Gayetal., 2007)。TAK 242可特异性地与TIR结构域结合，阻止其活化下游的衔接蛋白。本次研究表明，1 μg/mL的TAK 242处理16HBE细胞24 h后不会影响细胞的存活率，故可采用其作为研究TLR4信号通路的抑制剂。本研究证实TAK 242可以有效降低细胞上清液中IL-6与IL-8的浓度，推测TLR4转导途径的活化可能是石英粉尘致支气管炎症反应的潜在分子机制。Xu等(2018)使用TAK 242预处理小鼠巨噬细胞(RAW264.7)后，大气细颗粒物刺激产生的高浓度IL-1β现象被抑制，此外，免疫调节关键核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的表达也在TAK 242预处理后明显下调，证明TLR4信号通路与NF-κB信号通路间存在交叉，形成信号调节网络以维持机体响应大气细颗粒物刺激的免疫反应发生。

NF-κB是一种转录因子，可与炎症因子基因的启动子区结合从而上调其表达，如图6所示，除NF-κB 外，TLR4通路还包含了很多信号分子。在本次研究中，仅对细胞膜上的“信号开关”TLR4蛋白进行了检测，观察到TLR4的表达随石英粉尘悬液浓度增加而上调，然而却未对TLR4信号轴下游的蛋白，如髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)、β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)与石英粉尘之间的关系进行探索。此外，XRD分析显示本次实验所用的大气颗粒物主要物相为石英，研究表明(Rathinametal., 2013)TLR4的主要配体为细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，本实验将颗粒物置于103.4 kPa、121.3°C的条件下进行30 min的灭菌处理，不会造成LPS的丢失，因此需要进一步研究TLR4的激活是与LPS还是石英有关。深入了解TLR4及其上下游分子对炎症介质释放的影响，可以针对性地研制出大气中石英粉尘所致肺部疾病的治疗干预措施，这将是我们下一步的研究内容。

图 6 TLR4信号通路活化模式图Fig. 6 Activation pattern diagram of TLR4 signal pathway

4 结论

(1) 石英粉尘作用于16HBE细胞后，会刺激其分泌高浓度的IL-6与IL-8。

(2) TLR4特异性抑制剂TAK 242可以拮抗石英粉尘引发的高水平炎症因子和TLR4。

(3) 石英粉尘可激活 16HBE细胞的TLR4信号通路，诱导气道炎症反应的发生。