杨自华，郭平学，王西辉，吴 娟，张峰伟

西安医学院第二附属医院（西安710038）

胆管癌是一类起源于肝内或肝外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率占肝胆肿瘤总发病率的10%～15%。胆管癌恶性程度高，易发生转移，尤其易向肝动脉或门静脉侵袭［1］。由于诊断困难和手术治疗预后较差的原因，近年来胆管癌的发病率和病死率呈逐年上升的趋势，严重威胁着患者的生命［2］。目前，根治性切除手术是胆管癌患者得到治愈或长期生存的唯一手段［3］。由于胆管癌在发病初期并无明显症状，大多初诊患者已失去根治性手术治疗的机会。因此，有效诊断和评估胆管癌发生发展的生物学指标显得尤为重要［4］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一条具有20～25个核苷酸序列的内源性非编码RNA，可与特定m RNA 结合，抑制蛋白质翻译过程，从而产生相应的生物学效应［5］。miRNA 具有进化保守的特性，在肿瘤的发生过程中起重要作用。现有的研究显示，某些miRNA 在肿瘤组织的细胞增殖、细胞凋亡、分化、血管生成、迁移、代谢和侵袭过程中发挥关键作用［6］。miRNA-244与miRNA-328 在肿瘤患者中的表达有变化，而关于miRNA-244与miRNA-328在胆管癌患者中的研究尚无报道。本研究通过检测miRNA-244和miRNA-328在胆管癌患者血清中的含量变化，探究miRNA-244和miRNA-328 在胆管癌发生发展中发挥的病理生理学作用。

对象和方法

1 研究对象 本研究经西安医学院第二附属医院伦理委员会批准后进行，所有患者均签署知情同意书。选取2017年1月至2018年12月在西安医学院第二附属医院收治的胆管癌患者52例作为研究组，其中胆管癌未转移患者20例，胆管癌伴转移患者32例，选取同期收治的肝良性瘤患者43例作为对照组。胆管癌未转移患者纳入标准:①年龄18～70周岁；②初次就诊，入院诊断为胆管癌；③无胆管外淋巴及外周组织转移。胆管癌伴转移患者的纳入标准:①年龄18～70周岁；②初次就诊，入院诊断为胆管癌；③原发性胆管肿物或远处转移性病变经病理学诊断为胆管癌。根据病史排除恶性肿瘤，系统性免疫功能疾病，肾脏心脏功能不全等患者。

2 血清样本采集 所有研究对象于入院次日清晨7～8点以常规方法采集5 ml静脉血至无添加剂采血管中。血液样本于常温下放置1 h 后3000 r／min离心20 min，取上层1 ml血清至EP管中，加入1 ml Trizol试剂，于-80℃超低温冰箱中保存。

3 主要仪器与试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。实时定量PCR 试剂购自宝生生物技术有限公司。实时定量PCR 仪为Bio-Red 公司产品。-80超低温冰箱购自Thermo Fisher公司。

4 实时定量PCR 检测血清中miRNA 的表达

通过Trizol法提取血清RNA，进行擦除DNA 和反转录操作，得到cDNA 用于反转录，按照说明书配制反转录体系。实时定量PCR 采用两步法，条件如下:步骤一，预变性，95℃，30 s；步骤二，PCR 反应，95℃5 s，60℃30 s，此步骤循环40次。通过2-ΔΔCt法检测miRNA-244和miRNA-328的表达水平。本实验所用引物序列，见表1。

5 统计学方法 数据分析采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，绘制miRNA-244和miRNA-328诊断胆管癌转移的受试者工作特征曲线（ROC 曲线），计算ROC曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异性等。P＜0.05为差异有统计学意义。T T A

表1 引物序列

结 果

1 研究对象一般资料比较 见表2。对照组、胆管癌未转移组和胆管癌伴转移组患者性别和年龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 研究对象一般资料比较

2 血清中miRNA-244和miRNA-328表达水平比较 qRT-PCR 结果见表3、图1。胆管癌未转移组患者血清miRNA-244较对照组明显升高（P＜0.05），胆管癌转移组患者血清miRNA-244较对照组也明显升高（P＜0.05），说明miRNA-244可能是胆管癌促进发生、转移的关键因素和预测指标；胆管癌未转移组血清miRNA-328较对照组有降低趋势但无统计学差异（P＞0.05），而胆管癌伴转移组患者血清miRNA-328明显低于对照组（P＜0.05），说明miRNA-328可能对胆管癌的发生，转移有抑制作用并具有预测意义。

表3 各组miRNA-244和miRNA-328血清表达量比较

3 血清中miRNA-244和miRNA-328表达水平在胆管癌伴转移患者中的诊断价值 通过绘制miRNA-244和miRNA-328在血清中表达水平的ROC曲线，分别评价两者对胆管癌转移的诊断效能（图2）。血清中miRNA-244的表达水平佳界值为4.26，此时其灵敏度和特异度分别为73.0% 和60.1%，AUC 值为0.7225，（P=0.0161）；血清miRNA-328表达水平AUC值为0.5941（P=0.3346）。这些结果提示，血清miRNA-244的表达水平可以较好地区分胆管癌是否转移。

图1 血清中miRNA-244和miRNA-328的表达

图2 血清miRNA-244和miRNA-328诊断胆管癌伴转移的ROC曲线

讨 论

胆管癌是指原发于左右肝管汇合部至胆总管下端的肝外胆管恶性肿瘤。近年来，由于饮食习惯和医疗技术的发展，胆管癌的发病率呈逐年上升的趋势［7］。高龄和慢性胆道炎症刺激是胆管癌发生的病理生理学基础，临床治疗胆管癌常用的方法有手术治疗、放疗、化疗等［8-9］。而现有的胆管癌早期诊断和预后判断技术尚不成熟，难以早期发现胆管癌和有效评估预后，这导致胆管癌成为预后最凶险的恶性肿瘤之一，严重威胁患者的生命［10-11］。近年来的研究表明，miRNA 不但参与人体的正常生理活动，同时也与一些疾病的发生发展密切相关。有研究显示，特定的miRNA 对食道癌、胰腺癌及肝癌等恶性肿瘤的发生具有预测作用，可作为一些肿瘤的血清标记物。本研究显示，miRNA-244和miRNA-328在胆管癌的发生发展中血清的表达量均发生重大变化，因此有望利用miRNA-244 和miRNA-328对胆管癌的诊断和预后进行评估，有效提高患者的治愈率和生存率。

miRNA 是大约20～25个核苷酸长的单链RNA分子，miRNA 能够通过结合靶基因3′-UTR 区而发挥负向调控作用。有研究显示miRNA 在肿瘤发生和肿瘤转移中起重要作用。在各种类别的恶性肿瘤研究显示，因为难以从怀疑恶性肿瘤的患者获得有用的组织活检，miRNA 作为潜在的肿瘤诊断和预后的生物标志物越来越吸引更多研究者的目光。

在生理状态下，miRNA-244可通过抑制卵丘细胞中的Ptx3 分子延迟卵母细胞的成熟［12］，通过下调DMRT1促进生精细胞的自我更新［13］，同时可以抑制SMAD4分子的表达抑制多种来源的间充质干细胞向骨细胞分化［14］。在循环系统中，miRNA-244 可受血管紧张素II的影响而促进心肌纤维化形成［15］。在神经系统中，miRNA-244通过抑制SPG7，抑制脑缺血后神经细胞的凋亡［16］。关于肿瘤的研究中，miRNA-244同样扮演重要角色，miRNA-244 通过抑制m TOR 蛋白表达，激活Caspase-9／3 表达促进胃癌的生长和进展［17］；而且，miRNA-244亦可通过下调SUFU 蛋白的表达抑制膀胱癌细胞的生长和内皮向间充质干细胞的表型转化［18］。miRNA-244的表达量在宫颈癌中被上调，参与肝细胞癌的生成，并在肿瘤的迁移、侵袭和癌细胞增殖中发挥重要作用［19］，而在胰腺癌中miRNA-244亦发挥着类似的作用［20］。

miRNA-328在生理和病理状态下也发挥着重要的作用。研究显示，miRNA-328通过下调TGFβRIII，激活TGFβ1 通路促进心肌间质纤维化［21］。miRNA-328同时具有修复支气管上皮细胞的潜力［22］。而在肿瘤细胞的研究中，miRNA-328 通过抑制TCF7L2 蛋白，抑制肿瘤细胞生长和肿瘤形成［23］，通过转录后抑制PTPRJ蛋白促进肝癌细胞凋亡［24］，miRNA-328通过抑制CD44基因的m RNA，抑制鼻咽癌细胞的转移和内皮-间充质干细胞表性转化［25］。miRNA-328在白藜芦醇治疗骨肉瘤时会大量表达，通过抑制基质金属蛋白酶2抑制肿瘤细胞的迁移。miRNA-328 也可通过抑制磷酸酶来促进细胞凋亡，发挥抗癌作用［26］。同时miRNA-328具有抑制胰腺癌肿瘤细胞增殖和代谢的功能。

本研究胆管未转移患者和胆管癌伴转移患者的血清，进行实时定量PCR 检测。发现随着胆管癌病情的发展miRNA-244的表达量逐渐升高，而miRNA-328的表达量在胆管癌转移患者中降低。上述结果表明，miRNA-244和miRNA-328的检测在一定程度上有利于医生对胆管癌进行初筛。由于miRNA-244与miRNA-328均与肿瘤细胞的增殖、代谢、迁移和侵袭密切相关。通过ROC 曲线分析miRNA-244 与miRNA-328在胆管癌伴转移患者中的诊断价值，结果发现，miRNA-244可以有效的区分胆管癌是否转移。因此，血清中miRNA-244 和miRNA-328 水平有望成为胆管癌的可靠标志物。