杨宋玲 张庆平 曾秋玲 宁景春

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在内皮细胞维持中发挥重要作用，参与内皮化和新生血管的形成[1]。EPCs的这一优点对以缺血组织再生为目标的细胞治疗具有吸引力，体外扩张EPC可能有助于缺血性疾病的潜在临床细胞治疗。静脉注射自体EPCs是可行和安全的，并可能对特发性肺动脉高压成人的运动能力和肺血流动力学有有益的影响[2,3]。虽然这些研究为临床应用EPCs提供了各种见解，但潜在的细胞治疗方法的一个主要限制是循环血液中EPCs的数量有限(<白细胞的0.05%)[4]。因此，体外扩增EPCs是必要的。然而，EPCs的体外培养导致EPC衰老的迅速开始，从而严重限制了EPCs的增殖能力和克隆扩增潜力[5]。因此，关于潜在的细胞治疗方法，一个重要的问题是体外扩张引起的EPCs衰老是否可以通过药物、细胞因子治疗来延迟[6,7]。大多数抗癫痫药物在临床应用中的作用机制尚不完全清楚。抗癫痫药物可改变多种生理机制[8]。丙戊酸延迟EPCs衰老的发生，这可能与PI3K/Akt通路有关，我们研究了EPCs衰老和增殖的调控[9]。丙戊酸的剂量和时间可以显著增加EPCs的数量和活性，所以我们进一步阐明丙戊酸对EPC衰老的潜在作用。VM是高侵袭性肿瘤细胞模拟血管内皮细胞ECs形成高度排列的管状通道，这些通道发挥血管的功能，内壁完全由肿瘤细胞构成，不含ECs[9]。VM是一个多步骤的过程，包括肿瘤细胞的活化、增殖、肿瘤细胞向内皮样细胞分化和生成新的功能血管[10]。然而VM背后的许多机制仍然不清楚。因此我们研究抗癫痫药丙戊酸影响EPCs衰老和血管拟态的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 循环EPC的分离与培养:用Ficoll密度梯度离心法从健康志愿者的外周血中分离出单核细胞(MNCs)，并在199σ培养皿中培养，培养皿中加入10%胎牛血清和VEGF(50 ng/ml,Chemicon)。在激光扫描聚焦显微镜下，EPCs表现为黏附细胞双阳性，可吸收dildl并结合凝集素。通过流式细胞术显示KDR、CD34和AC133的表达，进一步证明了它们的存在。医学伦理学问题:所有实验程序经医学和健康研究伦理委员会批准，参与者在入组前均提供书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 菌落分析:培养4 d后，用EDTA轻轻分离粘附细胞。用100 ng/ml人重组VEGF将细胞(1×105)接种于甲基纤维素板中。平板在显微镜下进行研究，培养10 d后由两名独立研究者对菌落进行计数。

1.2.2 EPCs增殖试验:通过加入5-溴-2-脱氧尿苷(brdu)来评估EPC的增殖。细胞(1×104细胞/孔)在96孔塑料板中培养。将Brdu(10 μm)添加到培养基和细胞再培养18 h。根据说明书，用细胞增殖酶联免疫吸附测定试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)测定BrdU掺入量。

1.2.3 增殖活性测定:用比色法3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基氧基苯酚-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)分析测定有丝分裂活性。在每4小时加入丙戊酸进入EPCs后，培养14 d后收获EPCs，再在96个孔板(110个4个细胞)中接种0.1 ml EBM-2培养基，在重组人VEGF的存在下添加0.5%牛血清白蛋白(100 ng/ml；明尼阿波利斯，明尼苏达，美国)。培养24 h后，将MTS甲硫酸氢钠溶液添加到每个孔中3 h，并使用酶联免疫吸附测定板(美国马里兰州肯辛顿生物技术实验室)检测490 nm处的光吸收率。

1.2.4 衰老相关β-半乳糖苷酶活性测定:用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(biovision)测定衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-b-gal)活性。在PBS中清洗EPC，在室温下用0.5 ml固定液固定10～15 min，在37℃下用染色液混合物清洗和培养过夜。在显微镜下观察细胞是否出现蓝色(200倍总放大倍数)。

1.2.5 西方墨点法:采用丙戊酸治疗EPC 24 h。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上制备和分离细胞蛋白，分离后，蛋白质被转移到硝化纤维素膜(Amersham)。在含有0.1%(v/v)吐温20和5%(v/v)非脂肪干乳的Tris缓冲盐水(pH值7.5)中培养2 h，然后在室温下用多克隆抗磷酸Akt-Ser 473或抗Akt抗体(细胞信号技术)培养2 h，阻断细胞膜。过滤器在含有0.1%(v/v)吐温20的三缓冲盐水中广泛清洗，然后与过氧化物酶结合的二级抗阿巴特抗体培养1 h。然后使用EZ-ECL检测试剂盒(生物工业)冲洗。

1.2.6 荧光染料注射:通过静脉注射荧光染料证明VM，荧光团结合的凝集素与GFAP+胶质母细胞瘤细胞共定位，多普勒成像观察注射微泡，PI3K通路激活膜型基质金属蛋白酶-1。

1.2.7 培养基中血管内皮生长因子蛋白的测定:为了评估血管内皮生长因子蛋白的分泌，在第14天使用丙戊酸治疗的EPC(1×106)被切换到无生长因子培养基EBM-2，用5%胎牛血清培养72 h。根据说明书，使用市售的血管内皮生长因子夹心免疫分析(R&D系统)测量细胞培养基中的血管内皮生长因子蛋白。检测系统与血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子无交叉反应。

2 结果

2.1 丙戊酸阻止EPCs衰老 EPCs的培养导致SA-B-gal阳性细胞增加，与丙戊酸共培养可显著改变SA-B-gal阳性细胞，EPCs衰老的抑制作用与丙戊酸呈剂量依赖性差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 丙戊酸对EPCs增殖的影响 BrdU掺入试验表明，丙戊酸处理的EPCs的有丝分裂潜能超过未处理(对照组)EPCs，这一效应与剂量有关(P<0.05)。见表2。

2.3 丙戊酸对EPCs克隆扩增的影响 在丙戊酸存在或不存在的情况下，将1×105EPCs接种于甲基纤维素平板中。经过丙戊酸预处理的EPCs菌落数量明显高于对照组(P<0.05)。见表3。

表1 丙戊酸影响EPCS衰老结果

表2 丙戊酸对EPCs增殖的影响

表3 丙戊酸对EPCs克隆扩增的影响

2.4 丙戊酸对血管内皮生长因子分泌的影响 在72 h内，丙戊酸处理的EPC培养基VEGF浓度明显高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 丙戊酸对VEGF浓度的影响

2.5 丙戊酸通过PI3K/Akt通路诱导端粒酶活性 PI3K/Akt通路参与了丙戊酸诱导酶的激活。EPCs在与丙戊酸培养前，先用磷脂酰诺西醇3激酶(PI3K)阻滞剂wortmannin或LY294002预处理，然后评估酶的活性。无论是wortmannin还是LY294002都能明显减弱丙戊酸对酶活性的增加。接下来我们研究丙戊酸是否会诱导Akt磷酸化，用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用anti-phospho-Akt或anti-Akt antibody免疫印迹。丙戊酸刺激引起剂量依赖Akt的磷酸化，但并不影响Akt的总量。见表5。

表5 丙戊酸对EPCs酶活性的影响

2.6 丙戊酸激活PI3K通路 通过脉注射荧光染料发现丙戊酸通过PI3K通路激活膜型基质金属蛋白-1，膜型基质金属蛋白酶-1能够激活MMP-2的蛋白水解作用，从而影响VM。见图1。

图1 荧光染料染色图 PI3K通路也对应于VM的基底板连续切片双染色，验证丙戊酸通过PI3K通路激活膜型基质金属蛋白酶-1

3 讨论

肿瘤细胞形成毛细血管样结构可能需要凋亡细胞死亡来清除不包括在血管网中的多余细胞，而血管网没有开启导致肿瘤细胞向内皮样细胞分化的基因程序[11]。细胞衰老被广泛认为是一种末梢生长停滞的一般生理过程，可由有限数量的细胞分裂触发[12]。衰老细胞虽然不增殖，但其代谢和综合活性保持不变，其形态发生特征性变化，细胞形态变大、变平，胞质形态呈空泡状，颗粒度呈增大的[13]。衰老被认为是正常细胞中必不可少的抗癌程序，与凋亡类似，衰老也能干扰肿瘤生长。SA-B gal可以反映衰老细胞溶酶体重的增加，其表达被广泛用作细胞衰老的可靠指标[14]。一些肿瘤细胞为了促进VM结构的形成而激活凋亡和衰老。此外，衰老细胞还产生许多影响其他肿瘤细胞生长的因子，这些因子可能影响VM的形成。可见衰老参与VM的形成。丙戊酸能够阻止EPCs的衰老，而EPCs的衰老与高增殖能力和显著增加的克隆扩增有关[15]。EPCs是由外周血单个核细胞产生的，为了评估衰老，检测酸性b-半乳糖苷酶作为细胞衰老的生化标记物。EPCs的培养导致SA-B-gal阳性细胞的增加。与丙戊酸共培养可显著抑制SA-B-gal阳性细胞的增加。EPCs衰老的抑制作用呈剂量依赖性。BrdU掺入试验表明，丙戊酸能促进细胞增殖。

证明丙戊酸延缓衰老的发生后，我们研究了这种作用是否转化为增殖活性和血管内皮生长因子分泌的增加。血管内皮生长因子的分泌作为一种机制，可能有助于它们的促血管生成作用。MTS分析表明，丙戊酸处理的EPC的有丝分裂潜能超过了未处理EPC的有丝分裂潜能，丙戊酸处理的EPC的培养基中的VEGF浓度明显高于未处理的EPC。

Akt在调节细胞衰老方面发挥重要作用。此外，PI3K/Akt通路在阿托伐他汀介导的EPCs衰老预防中发挥重要作用[16]。我们检验了PI3K/Akt通路参与了丙戊酸诱导的激活。EPCs在与丙戊酸培养前，先用磷脂酰诺西醇3激酶(PI3K)阻滞剂wortmannin或LY294002预处理，然后评估其酶活性。无论是wortmannin还是LY294002都能明显减弱丙戊酸对酶活性的增加。丙戊酸诱导Akt磷酸化，Akt是PI3K的下游效应因子。用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用免疫印迹法，丙戊酸刺激引起剂量依赖Akt的磷酸化，但并不影响Akt的总量。我们发现丙戊酸显著增加了Akt磷酸化。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，也被称为蛋白激酶B，通过在人脐带内皮细胞和黑色素瘤细胞中磷酸化叔丁基化来增强酶活性。除了叔丁酸的直接磷酸化，Akt也可能通过增加内皮一氧化氮合酶(enos)的活性，因为已经证明一氧化氮能延缓内皮细胞衰老。然而，非供体亚硝基异戊胺(SNAP)并不能阻止EPC的衰老和抑制NO合成酶的表达。G-单甲基-L-精氨酸(LNMA)没有加速EPC衰老的发生，这表明EPC衰老的调节独立于NO。数据表明丙戊酸增加了EPC中的Akt磷酸化，这可能导致叔丁酸的磷酸化增加。叔丁酸磷酸化的增加可能增强酶活性，从而阻止EPC的衰老。

丙戊酸通过PI3K通路激活膜型基质金属蛋白酶-1，在VM的发生中起重要作用。膜型基质金属蛋白酶-1能够激活MMP-2的蛋白水解作用，后者将LN-5γ2链水解后形成的片段有助于VM发生过程中肿瘤细胞的迁移。

综上所述，本研究结果表明丙戊酸通过激活酶和Akt磷酸化延缓EPCs衰老的发生。丙戊酸对EPCs衰老的抑制作用和体外诱导EPCs增殖可能提高EPCs的功能活性，对潜在的细胞治疗具有重要意义。丙戊酸通过PI3K通路断拮抗VM的发生。