房志琴 张鹏祥 彭伟 张玉平 王亚玲

随着人们生活水平提高，肥胖率逐年增加，2013年，全球肥胖和超重人群已达 21 亿，较20世纪80年代增长约27.5%[1]。儿童肥胖也迅速蔓延，发达国家的儿童肥胖患病人数呈倍数增长，发展中国家近20年的增长率更是超过了发达国家[2]。肥胖和超重妊娠比例也逐年增加[3]。妊娠前肥胖和超重与子代远期患高血压等相关心血管疾病密切相关[4]。心血管自主神经功能紊乱参与多种心血管疾病，例如高血压、心力衰竭及心律失常等[5]。心率变异性(heart rate variability，HRV)是一种无创性检查心脏自主神经调节功能的一种手段，具有可重复性、可定量、及高敏感性等优点[6]。压力反射敏感性(baroreflex sensitivity，BRS)反映心血管反射中血压的变化引起相应的心率反射性变化的敏感性。可作为反映自主神经功能的指标，在高血压、冠心病以及心律失常等自主神经功能受损疾病中均存在预测价值[7]。目前关于高脂饮食对子代鼠对血压和心率调控是否异常，其压力感受器反射敏感性和心率变异性有无差异，笔者发现在国内鲜有报道，因此我们的研究为高脂饮食子代心血管异常的机制研究提供理论依据，为预防超重和肥胖妊娠对子代不良妊娠结局的影响提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠，SPF 级，雌20只，雄10只，体重(250±10)g，购自北京军事医学科学院实验动物中心，动物合格证书 SCXK-军 2018-0004。隔离环境下饲养，12 h 昼夜交替，温度(23±2)℃，相对湿度：40%～80%，随意取食。适应性喂养 1 周，雌雄比例2∶1合笼，次日晨9∶00做阴道拭子，涂片后在光镜下观察到精子为受孕成功，当日记为妊娠第1天，孕鼠随机分成普通饲料喂养组(OCC组)和高脂饮食组(OHH组)，每组10只。子代出生3 d将雌鼠剔除，雄鼠小笼喂养，雄性子代普通饲料组(OCC组)哺乳期仍正常饲料喂养，高质饮食组(OHH组)哺乳期仍高脂饮食喂养，21 d断乳后2组均给予维持饲料直至3个月大。2组饲料含钠量一致，因此本实验所用饲料含钠量对2组间血压无差异。饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证书：京饲证(2014)06057。普通饲料(型号1032，含蛋白质27.38%，脂肪14.5%，碳水化合物58.12%，能量值3.48 kcal/g)，高脂饲料(型号 H10060，含蛋白质20%，碳水化合物20%，脂肪60%，能量值5.24 kcal/g)。本研究经河北北方学院科技中心动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 股动静脉置管术:每组随机选取6只3月龄子代雄鼠，3%异氟烷诱导箱中诱导麻醉，1.5% 异氟烷面罩维持麻醉并固定于保温台，保持温在37℃～38℃。股动脉、股静脉置管，分别用于记录血压和给药，聚乙烯管PE-50 14 cm与PE10管8 cm拼接制成一个插管，PE10 管端向前经股动脉插入腹主动脉(插到膈肌以下水平)，用来描记血压。股静脉同样置管进入下腔静脉，用于给药。聚乙烯置管经背部皮下隧道在两肩胛骨之间穿出，动、静脉置管暴露体外约2 cm，缝扎、粘合，过程中保证两管通畅，灌注肝素后塞子封堵。手术后3 d内，每天腿部肌内注射青霉素(4万U/只) 防止感染。

1.2.2 压力感受器反射检测:动静脉置管术后恢复3 d 进行感受器反射功能检测，动脉管连接压力传感器 ML880，通过 Powerlab 四通道生物机能试验系统，持续描记清醒动物血压和心率变化。静脉插管缓慢泵入α受体选择性激动剂苯肾上腺素(phenylephrine hydrochloride，PE)1.0 mg/ml升高血压，血压升高30 mm Hg后停止给药，血压回落至基线水平后(约50～60 min)，缓慢泵入硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)2.0 mg/ml降低血压，来诱发心血管压力感受反射。整个过程控制灌流速度(0.003 ml/min)，使血压 30～45 s时间内，升高或降低 30～40 mm Hg。为排除起始血压和心率对压力感受器反射敏感性变化的影响，用给予PE和SNP期间血压变化值与心率变化值关系的回归线的斜率，来表示压力感受器反射敏感性。

1.2.3 无线遥测植入子植入术:所有实验物品消毒，植入子浸入2%戊二醛消毒12 h，手术前将无线遥测系统的植入子(TA11PA-C40，DSI)放在无菌生理盐水中浸泡15 min，去除戊二醛。每组再随机选取6只3月龄子代雄鼠，同样异氟烷面罩维持麻醉，将植入子导管插入股动脉5 mm，胶水凝固血管穿刺处，发射器主体固定于腹腔内侧，加少量青霉素，腹腔脏器复位后缝合腹膜及皮肤，并用酒精消毒缝合处。用磁开关打开发射器内的电源，用小型调幅AM接收器检测接收到高频信号。手术后3 d内，每天腿部肌内注射青霉素(4万U/只) 防止感染。术后5 d进行连续记录动物在清醒自由活动状态下的血压和心率。

1.2.4 心率变异性测定:通过Dataquest软件描记大鼠血压和心率，设置采样频率为1 000 Hz，每小时采样1次，每次采样5 min，监测24 h。应用HRV分析软件Cardioseries分析HRV，时域指标：相邻RR间期差值平方和的均方根(RMSSD)，频域指标LF、HF及LF/HF。根据文献报道，大鼠的频谱分析频段划分为：极低频(VLF)为0.04～0.1 Hz，低频(LF)0.1～1.0 Hz，高频(HF)为1.0～3.0 Hz，作为分析数据取相应归一化数据(单位为normalized unit，n．u)。

2 结果

2.1 2组压力感受器反射敏感性比较 OHH组给予苯肾上腺素升压诱发心率下降的敏感性与OCC组比较显著减小(P<0.05)。此外，OHH组大鼠给予硝普钠降压诱发心率增快的敏感性与OCC组比也显著减小(P<0.05)。OHH组压力反射线的斜率值均小于OCC组(P<0.05)。见图1、2，表1。

图1 苯肾上腺素诱导2组平均动脉压和心率变化的压力反射线

图2 硝普钠诱导2组平均动脉压和心率变化的压力反射线

指标OCC组OHH组PE -3.08±0.33-1.36±0.26SNP-4.54±0.89-2.08±0.22

2.2 2组基础平均动脉压和心率比较 2组基础状态下，平均动脉压和心率无明显差异。见表2。

表2 2组基础平均动脉压和心率比较

2.3 2组HRV指标比较 时域指标:RMSSD，频域指标:LF、HF、LF/HF。2组HRV时域RMSSD比较：实验组RMSSD显著低于对照组(P<0.05)，2组HRV频域LF、HF、LF/HF比较，实验组LF及LF/HF显著高于对照组(P<0.05)，HF显著低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 2组HRV指标比较

3 讨论

超重和肥胖妊娠，会对母儿两代甚至隔代的健康产生深远影响。因其不仅增加妊娠女性妊娠并发症及远期慢病的风险，还能引起子代远期肥胖、心血管疾病等一系列健康问题，并在代际间引起肥胖及慢病的传递[8]。超重和肥胖女性机体内炎性因子、激素、胰岛素、三酰甘油、瘦素等代谢调控因子水平较高，影响卵母细胞的成熟和功能，进而降低胚胎质量[9]。此外，还有研究认为，高脂血症可破坏卵母细胞的代谢调节功能并引起内质网应激，从而使某些蛋白质在生物合成过程中发生错误折叠，从而引起子代远期代谢和心血管疾病的发生[10]。总之，孕期营养过剩可增加子代心血管疾病发病风险这一关系已明确，多项研究表明表观遗传学在其中发挥重要作用，高脂饮食子代一些相关基因通过甲基化促心肌细胞纤维化和肥厚[11]。

本研究应用无线遥测技术，在实验动物清醒状态下连续、动态监测生理参数的方法，虽然此方法费用较高，但所获数据更为真实，我国2013版《药物安全药理学研究技术指导原则》明确指示测定清醒动物心血管系统指标的采用此法[12]。

高脂饮食诱导的子代肥胖中存在性别差异，并且雄性后代更容易发生肥胖[13]。为此，我们的研究比较了高脂饮食和普通饲料子代雄鼠，在基础状态下平均动脉压和心率，2组无明显差异。国外一些研究也得出类似结果，Xue等[14]报道了高脂饮食子代表现为交感神经活性增高，可增敏血管紧张素Ⅱ所致的升压效应，但10周龄基础血压无明显升高。然而，Samuelsson等[15]研究显示在怀孕前(5～8周)、怀孕期间和哺乳期间长期喂养高脂饲料的母鼠表现出明显的肥胖，她们的后代从幼年期(30 d)血压就升高了，交感神经诱导以及黑素-4受体在高瘦素血症引起的高血压中发挥关键作用。不同的研究机构高脂饮食子代血压和心率有无变化，什么时间变化，结论有差异性，这可能与高脂饮食周期长短及测血压的时机有关。

心血管系统自主神经系统由交感和副交感神经共同构成，正常情况下，两者处于动态平衡，若功能紊乱就引起多种心血管疾病[16]。孕期肥胖预调后代使其易患高血压，一个可能机制是这些后代调节心血管活动的自主神经平衡偏向了交感神经兴奋[17]。鉴于高血压发病率逐年增高，发病年龄逐步年轻化，人们逐渐将注意力转向高血压前期。一项临床研究表明，高血压前期的发生可能与自主神经功能失调有关。长时间的交感神经系统持续兴奋，会使外周血管平滑肌收缩，血管阻力加大，进而使血压升高。自主神经功能紊乱、交感神经亢进是产生并维持高血压的始动因素之一[18]。心脏自主神经系统功能失衡早期常无特异性临床表现，诊断较为困难。功能紊乱是一个逐步恶化的过程，最初是迷走神经功能受损，进而发展至交感神经功能过度亢进，随着自主神经调节失衡加重，HRV等参数随之发生不同程度异常，最终导致心血管事件发生。患者心脏迷走神经活性降低，交感神经活性增强，空腹血糖、收缩压、年龄、甘油三酯水平等多种心血管危险因素可能是心脏自主神经功能紊乱密切相关[19]。我们的3月龄子代鼠虽然没有出现基础血压升高，但我们猜测已经处于高血压前期状态，存在一定的自主神经功能紊乱，迷走神经活性减退，交感神经相对亢进。Zhang等[20]研究，10周龄高脂饮食子代压力反射敏感性受损、心率变异性降低，子代的自主神经调控出现异常，我们的研究与此结论一致。

HRV分为线性和非线性分析法，其中线性分析法又可分为时域、频域和时频分析法等，时域指标RMMSD代表迷走神经对窦性心率的调控作用的大小，其值越低，迷走神经的张力也越低，交感神经的功能也就越亢进[6]。频域分析法中HF表示副交感神经的活动，而LF既反映了交感神经也反映了副交感神经的作用，但主要由交感神经控制，LF与HF之比通常用来衡量交感与副交感神经系统的均衡性。现已证实刺激迷走神经时，HRV随之增高；刺激交感神经时，HRV 随之下降[12]。我们的研究结果表明，高脂组反映迷走神经张力的指标RMSSD和HF均明显低于对照组(P<0.05)，主要反映交感神经活性的LF高于对照组(P<0.05)，反映交感-迷走神经系统平衡状态的LF/HF比值高于对照组(P<0.05)。这表明高脂饮食子代雄鼠交感-迷走神经功能不均衡，且交感神经相对兴奋。

心血管调控中心下丘脑接受来自动脉压力感受器、心肺压力感受器的传入信息，通过交感和副交感神经将这些信号传给心脏、血管和肾脏等效应器官[21]。压力感受器敏感性(BRS)在机体维持稳态的调节中发挥着重要的作用，我们可通过BRS来预见多种疾病的预后和转归。若BRS差，则血压波动不足以被抑制，表现为血压变异性大，而相应的心率变异性却减小。血管活性药物法测BRS，已得到大量数据认可，安全、可靠，是目前最常用的经典方法之一，间接评价迷走神经对心脏的作用，常用药物包括PE、血管紧张素Ⅱ和SNP等[7]。本研究中实验组血压升高的过程中心率的变化并不明显，BRS敏感性降低，这表明高脂饮食子代发生自主神经功能变化，BRS受损其调节能力明显低于正常饮食子代，也就是说高脂饮食子代对任何原因引起的血压波动刺激反应性降低，不能抑制交感神经的兴奋性，迷走神经在血压改变时候的反应能力处于劣势。在一些病理状态下例如高血压或糖尿病，BRS会降低，且女性患者降低幅度高于男性，因此，推测压力感受器反射功能可能存在性别差异[22]。那么在动物模型中，病理状态下BRS是否存在性别差异，有待于更深入研究。

围产期高脂饮食可导致生命早期高血压，一项国外研究将肠道微生物靶向治疗作为高血压的再编程治疗策略值得进一步的临床研究[23]。同时一些改善自主神经功能的研究国内外也开展，黄俊杰等[24]发现高脂高糖饮食能导致兔心脏自主神经功能紊乱，并促进AS发生，蜂王浆干预后能调整自主神经功能，延缓AS病变。目前，颈动脉压力感受器激活疗法和肾神经去除术已经在临床实验中得到评估，这些方法就是通过调节自主神经系统来控制难治性高血压[21]。Xue等[14]也表明，妊娠期肥胖母鼠的子代对血管紧张素Ⅱ诱导的升压反应增强，这种升压效应可通过肾去神经来逆转。但是，临床上用来调节自主神经功能，提高BRS的治疗方法和药物目前仍有限，期待未来有更好的手段来治疗自主神经失调相关性疾病。