胡燕 尹明智 冶飞碟

摘 要：油菜细胞质雄性不育杂种是当前油菜杂种优势利用的主要途径，而恢复基因的连锁标记研究对于恢复系的选育和改良至关重要。本研究基于前期研究结果设计引物对与油菜细胞质雄性不育系1193A恢复基因连锁的2个SNP位点进行TSP标记分析，以期建立一种简单高效易行的油菜雄性不育系1193A恢复基因的SNP分析方法。结果表明，设计的2对TSP标记引物扩增效果较好，可用来进行后续的研究分析。

关键词：油菜;不育系;恢复基因;SNP;TSP

中图分类号：S-3       文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530007

油菜是我国主要的油料作物之一，具有明显的杂种优势，油菜细胞质雄性不育系统（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）是当前油菜杂种优势利用的主要途径，也是最重要的传粉控制系统之一。油菜CMS系统一般包含不育系、保持系和恢复系，而不育系的应用需选育强优势恢复系用来配制强优势杂交种，这对油菜杂种优势的利用是至关重要的[1]。常规的育种方式需大量杂交，育种周期长，工作量大。随着测序技术以及生物技术的发展，分子育种手段也随之发展，其中分子标记技术在分子育种中应用最为广泛。分子标记方法不受外界环境因素的影响，对基因定位及分子育种有重要作用。SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）作为第3代分子标记，目前已广泛应用于遗传分析，是一种便于分析，遗传稳定性强的分子标记[2]。SNP的检测方法众多，但有些技术方法较难掌握，且应用成本较大。TSP（Temperature Switch PCR）方法，是由Tabone等[3]提出，优点是只需经过一轮PCR，就可以直接通过琼脂糖凝胶电泳检测SNP位点，方法简便易行。目前TSP方法在大麦[4]、小麦[5]、葡萄[6]等物种的SNP位点检测分析中都有了成功的应用。

前期研究中通过属间杂交获得了油菜新型胞质雄性不育系1193A[7]，并通过大量的测交发现了其恢复系。通过油菜60K SNP芯片，结合BSA法将恢复基因初步定位在C09染色体上，并发现了2个连锁的SNP位点[8]，本研究将对这2个SNP位点进行TSP标记分析，以期建立一种简单高效易行的油菜雄性不育系1193A恢复基因的SNP分析方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

不育系1193A与恢复系1193R2的种子均由国家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 油菜基因组DNA的提取

利用CTAB法提取基因组总DNA。

1.3 TSP标记检测SNP位点

根据前期油菜60K SNP芯片分析的研究结果[8]，本研究对Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830 2个SNP位点进行TSP标记的引物设计，其引物设计原则参照Tabone等提出的原则进行设计[3]。设计2个位点特异性引物和1个等位基因特异性引物，其中，位点特异性引物是在SNP位点的两侧，引物退火温度为63℃，等位基因特异性引物在SNP位点上游，退火温度为45℃，然后在5′端人工添加2～3bp的核苷酸序列[6]。

PCR反应体系为20μL，其中包括：ddH2O 10.6μL，10×缓冲液2μL，每个引物0.2μmol/L，dNTPs 0.2μmol/L，Taq酶1U，DNA 50ng。PCR扩增程序为：95℃预变性5min;先94℃40s，60℃40s，72℃40s，15个循环;然后94℃10s，45℃30s，5个循环;最后94℃40s，54℃40s，72℃10s，15个循环。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2 结果与分析

2.1 SNP位点及引物设计

针对SNP标记分析时TSP方法设计引物的要求，对前期研究开发的位于C09染色体上的，与恢复基因连锁的SNP位点Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830进行了分析，并设计TSP标记引物用于后续的检测分析。

2.2 SNP位点TSP标记分析结果

用3对TSP标记引物对2个SNP位点进行PCR扩增检测，结果显示：有2对TSP标记引物能扩增出与预期长度相吻合的PCR产物，电泳条带较清晰。如图1所示，利用引物TSP1和TSP2对候选SNP位点A/G进行TSP标记分型，从电泳条带可得出，引物TSP1檢测不育系1193A在720bp和380bp左右各有1条带，引物TSP2检测不育系1193A在720bp和200bp左右各有1条带，而恢复系1193R2均是在720bp左右的1条带，说明通过TSP1和TSP2标记能够检测Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044所在的SNP位点差异。而设计的TSP3标记引物对Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830处的SNP位点进行检测没有获得预期的结果，可能是引物设计不合理，或PCR条件不佳造成的。

3 讨论

油菜CMS系统有同源胞质不育系和异源胞质不育系。不育系1193A为属间杂交后代选育而来的异源胞质不育系，而这种不育系往往存在恢复源较窄的问题。为了有利于发现更多的恢复源材料，选育出恢复系，人们常常会将不育系与大量的材料进行广泛杂交，再观察杂交后代的育性表现，但这样工作量大，时间较长。分子标记辅助育种技术能缩短育种周期，近几年在作物品种育种中发挥了重要作用，日渐受到育种家的喜爱。对恢复系进行分子标记研究，找到与恢复基因紧密连锁的标记，可为恢复系的选育提供技术支撑，提高选择效率和准确性。TSP标记引物检测方便，成本较低，结果的可靠度也较高，只需进行一轮PCR即可直接从电泳结果分析SNP位点，是AS-PCR的升级版[9]，适用于一般实验室开展SNP检测。本研究设计了TSP标记引物3对，用于检测不育系1193A恢复基因的SNP位点差异，结果表明，其中2对扩增效果较好，可用来进行后续的研究分析。这为通过简单易行的方式选育恢复源材料提供了技术支撑。

参考文献

[1] 程计华，李云昌，梅德圣，等.几种农作物细胞质雄性不育恢复基因的定位和分子标记研究进展[J].植物学通报，2006，23（6）：613-624.

[2]Kim S，Misra A. SNP genotyping：Technologies and biomedical applications[J]. Annual Review of Biomedical Engineering，2007（9）：289-320.

[3] Tabone T，Mather D，Hayden M. Temperature Switch PCR（TSP）：Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs[J]. BMC Genomics，2009，10 （1）：580.

[4] Hayden M J，Tabone T，Mather D E.Development and assessment of simple PCR markers for SNP genotyping in barley[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119 （5）：939-951.

[5] Huang X Q，Brlé-Babel A. Sequence diversity，haplotype analysis，association mapping and functional marker development in the waxy and starch synthase IIa genes for grain-yield-related traits in hexaploid wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Mol Breeding，2012（30）：627-645.

[6]郭大龍，李猛，张国海，等.葡萄SNP标记的CAPS和TSP分析[J].园艺学报，2013，40（11）：2307-2315.

[7]尹明智，官春云.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系1193A的选育及分析[J].西南农业学报，2017，30（9）：1947-1953.

[8]尹明智.野油胞质雄性不育系1193A的研究[D].长沙：湖南农业大学，2014.

[9]雷天刚，何永睿，彭爱红，等.柑橘CAPS标记和AS-PCR引物的开发[J].园艺学报，2012，39（6）：1027-1034.

（责任编辑 贾灿）