郭 洁,刘 齐,刘成浩,韩萧茜,杨 玲,杜 勇

(北京市药品检验所,北京102206)

随着经济的发展和社会的进步,人们对健康和美丽的追求愈加强烈。为了避免紫外线辐射对皮肤造成的各种损伤以及追求白皙肤色的审美要求,采取积极有效的防晒措施已经成为大众的共识。为满足人民群众日益增长的需要,研究人员不断研发多种配方多种剂型的防晒产品,使用频率呈现明显的增大趋势。但防晒剂的过多使用,会使人体产生诸如过敏、接触性皮炎等不良反应[1-7]。因此,国家对防晒产品的监管和要求日趋严格,如防晒剂应与批准配方一致,且应在产品标签上标明,其含量应符合相产规定。2015年版《化妆品安全技术规范》[8]中,规定了苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的高效液相色谱方法,所测定项目涵盖了目前市售防晒产品中使用的绝大多数化学类防晒剂,可准确测定其含量。但是该方法需要同时使用15种标准品,提高了检测成本,分别配制对照品溶液也增加了操作时间,不利于检验工作的高效完成。

一测多评法整合了内标、校正因子、紫外百分吸收系数等方法的优势,借助待测物中有效成分的内在函数和比例关系,以一个标准品为参照物,建立该成分与其他成分间的相对校正因子,并通过其计算含量,实现多组分的同时测定。该方法可以减少标准品使用数量,降低检测成本,节约检测时间,已经在中药材、中成药及食品的质量评价中得到了较为广泛的应用[9-21]。

本工作依据文献[22-24]的技术要求,建立一种简便高效的测定防晒产品中多种防晒剂含量的分析方法,确定以二苯酮-3为参照物,采用一测多评法测定苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮-4、对氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸异戊酯、4-甲基苄亚基樟脑、二甲基PABA乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奥克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚和双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪等15种防晒剂的含量,并采用回归方程法同步测定并加以验证。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient-1100型高效液相色谱仪;岛津LC-20AD高效液相色谱仪;Waters e2695型高效液相色谱仪(方法学考察所用);Mettler Toledo XS-205型电子分析天平;SB-25-12D型超声波清洗器;Mili-Q Advantage型纯水机。

苯基苯并咪唑磺酸标准储备溶液:4.950 g·L－1,称取适量苯基苯并咪唑磺酸标准品,用1 mol·L－1氢氧化钠溶液1 mL溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中,用体积比为250∶450∶300∶0.2的甲醇-四氢呋喃-水-高氯酸混合溶液(以下简称为混合溶剂)稀释至刻度,混合均匀。

二苯酮-4、对氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸异戊酯、4-甲基苄亚基樟脑、二甲基PABA乙基己酯标准储备溶液:分别称取各标准品适量,用稀释溶剂溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中,用混合溶剂稀释至刻度,混合均匀,配制5.073,5.060,5.041,5.226,5.048,5.123 g·L－1的二苯酮-4、对氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸异戊酯、4-甲基苄亚基樟脑、二甲基PABA乙基己酯的标准储备溶液。

丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奥克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪标准储备溶液:分别称取各标准品适量,用四氢呋喃溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中,用四氢呋喃稀释至刻度,混合均 匀,配制 5.018,5.393,5.208,5.089,5.323,1.088,1.036,1.007 g·L－1的丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奥克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的标准储备溶液。

苯基苯并咪唑磺酸标准品(批号为155797,纯度为93.6%)、二苯酮-4标准品(批号为20102,纯度为99.0%)、对氨基苯甲酸标准品(批号为112395,纯度为99.9%)、二苯酮-3标准品(批号为14971-01,纯度为100%)、P-甲氧基肉桂酸异戊酯标准品(批号为G0L414,纯度为98.9%)、4-甲基苄亚基樟脑标准品(批号为 G161980,纯度为99.0%)、4-甲基苄亚基樟脑标准品(批号为102303,纯度为99.0%)、二甲基PABA乙基己酯标准品(批号为102303,纯度为99.2%)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷标准品(批号为40814,纯度为98.9%)、奥克立林标准品(批号为752831,纯度为98.7%)、甲氧基肉桂酸乙基己酯标准品(批号为B0002222,纯度为99.8%)、水杨酸乙基己酯标准品(批号为G131868,纯度为99.4%)、胡莫柳酯标准品(批号为40429,纯度为99.6%)、乙基己基三嗪酮标准品(批号为F0 H178,纯度为99.5%)、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚标准品(批号为G155801,纯度为99.9%)和双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪标准品(批号为F0G275,纯度为98.7%)等15种防晒剂标准品。

四氢呋喃和甲醇均为色谱纯;高氯酸为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

CAPCELL PAK C18色 谱 柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流量为1.0 mL·min－1;柱温为30℃;检测波长为311 nm;进样体积为10.0μL。流动相:A为甲醇,B为四氢呋喃,C为0.008 2 mol·L－1高氯酸溶液,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 试验方法

取本品弃去部分(细颈容器内样品弃去最初挤出的1 cm样品,广口容器内样品刮弃表面层),称取0.25 g样品于25 mL具塞试管中,加15 mL混合溶剂溶解,涡旋混匀,超声提取30 min,用稀释溶剂稀释至刻度,在8 000 r·min－1转速下离心10 min,移取上清液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用稀释溶剂定容,混合摇匀后经过0.45μm滤膜过滤,得到待测溶液,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对15种防晒剂的混合标准溶液和编号为291的实际样品进行测定,色谱图见图1。

图1 15种防晒剂混合标准溶液和实际样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of 15 sunscreen agents mixed standard solution and the substantial sample

由图1可知:15种防晒剂的分离效果良好,且该方法对于实际样品中防晒剂的测定无干扰,说明该方法对于测定防晒产品中的防晒剂是可行的。

2.2 标准曲线

按照仪器工作条件对15种防晒剂的混合标准溶液系列进行测定,以各防晒剂的质量浓度为横坐标,与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:15种防晒剂在一定范围内与其对应的峰面积之间呈线性关系,线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性范围、线性回归方程和相关系数Tab.2 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient

表2 (续)

2.3 精密度试验

对15种防晒剂的混合标准溶液平行测定6次,记录各防晒剂的峰面积。结果发现:苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)分 别 为 0.30%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.20%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.30%,0.60%,0.20%,0.50%,0.30%,说 明 该 方 法的精密度良好。

2.4 稳定性试验

将15种防晒剂的混合标准溶液分别放置0,4,8,12,24 h后进行测定,记录各防晒剂的峰面积。结果发现:苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的色谱峰面积的 RSD 分别为 0.90%,0.80%,0.80%,1.1%,0.60%,0.90%,1.2%,0.70%,0.60%,1.1%,1.4%,1.0%,0.80%,0.80%,0.70%,表 明15 种 防 晒剂的混合标准溶液在24 h内能够稳定存在。

2.5 相对校正因子的计算

试验采用多个质量浓度点计算相对校正因子,计算方法见公式(1):

式中:fsi为相对校正因子;As为参照物标准品s的峰面积,μV·s－1;ρs为参照物标准品s的质量浓度,mg·L－1;Ai为待测组分标准品i的峰面积,μV·s;ρi为待测组分标准品i的质量浓度,mg·L－1。

以二苯酮-3为参照物,根据进样量不同,分别计算其余14种防晒剂的相对校正因子,以其平均值作为最终结果,并计算相对校正因子的RSD,结果见表3。

表3 14种防晒剂的相对校正因子Tab.3 Relative correcting factors of the 14 sunscreen agents

结果表明:不同进样体积所求得的相对校正因子重现性较好,RSD为0.20%～2.0%。

2.6 相对保留时间的确定

试验以二苯酮-3为参照物,分别计算其余14种防晒剂的相对保留时间,计算方法见公式(2):

式中:tRa为待测组分的保留时间,min;tRs为参照物的保留时间,min;ras为相对保留时间。

苯基苯并咪唑磺酸等14种防晒剂的相对保留时间见表4。

2.7 系统耐用性考察

试验通过将本方法中所选用的CAPCELL PAK C18色谱柱更换为不同品牌型号的色谱柱(ZORBAX SB-C18色谱柱、inertsilODS-3色谱柱、Kromasil 100-5-C18(Kromasil)色谱柱和UG-120色谱柱)来考察相对校正因子及相对保留时间的变化情况,结果发现:ZORBAX SB-C18色谱柱对15种防晒剂的分离效果良好,相对校正因子变化幅度较小,相对平均偏差(RAD)为0.10%～2.8%,具体见表5;其他型号的色谱柱对的15种防晒剂的分离效果均不理想,部分防晒剂无法实现基线分离,这是由于2015年版《化妆品安全技术规范》[8]中15种防晒剂的测定方法对于色谱柱具有一定的选择性。因此,在所选的色谱柱可完全分离15种防晒剂的情况下,本方法具有适用性。

表4 14种防晒剂的相对保留时间Tab.4 Relative retention time of the 14 sunscreen agents

试验进一步比较了CAPCELL PAK C18色谱柱和ZORBAX SB-C18色谱柱这两种类型的色谱柱对15种防晒剂的相对保留时间,计算RAD,结果见表6。

表5 不同色谱柱测得相对校正因子Tab.5 Relative correction factors determined with different chromatographic columns

表6 不同色谱柱的相对保留时间Tab.6 Relative retention times determined with different chromatographic columns

15种防晒剂在22 min内出峰完毕,某些防晒剂间距较近(例如峰5和峰6的出峰间隔为0.31 min,峰8和峰9的出峰间隔为0.33 min,峰11和峰12的出峰间隔为0.21 min),仅以相对保留时间定位可能造成混淆,因此在今后的试验中可采用适当增加对照品定位的方式(除参照物二苯酮-3以外,还可增加对氨基苯甲酸、P-甲氧基肉桂酸异戊酯、奥克立林、水杨酸乙基己酯和乙基己基三嗪酮)辅助确定各个防晒剂的准确位置,在使用少量对照品的情况下,即可准确进行多种防晒剂含量的测定。

同一液相系统调整柱温后,相对校正因子重现性良好,RSD为0.10%～1.6%,具体见表7,表明该方法可适用于不同的试验环境。

表7 不同柱温测得相对校正因子Tab.7 Relative correction factors determined at different column temperatures

分别更换不同品牌型号的液相色谱仪后,相对校正因子重现性良好,RSD为0.60%～1.7%,具体见表8。

试验表明,该方法可适用于不同的色谱系统。

表8 不同仪器测得相对校正因子Tab.8 Relative correcting factors determined with different instruments

2.8 样品分析

分别采用标准曲线法(SCM)和一测多评法(QAMS)计算24批样品中防晒剂的含量,并计算测量值的RAD,其中批号为291、294和298的测定值和RAD见表9。批号为140、400和78的测定值和RAD见表10。

表9 批号为291、294和298的样品分析结果Tab.9 Analytical results of samples with lot numbers 291,294 and 298 %

结果表明:两种方法对于多个组分测定值的RAD为0.10%～2.5%,且SCM 和 QAMS的测定结果基本一致。

本工作建立了市售防晒产品中苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的一测多评测定方法,在改变柱温及更换仪器的条件下,相对校正因子重现性较好。测定了24批市售防晒产品,对比了一测多评法和标准曲线法的测定结果,证明两种方法得到的测定结果基本一致,可以在确定色谱柱型号的前提下,实现以二苯酮-3为参照物,对防晒产品中15种防晒剂的含量进行同时测定。原方法需称量15种防晒剂标准品,分别制成标准储备溶液后,再配制混合标准溶液系列进行测定。采用一测多评方法仅需称量二苯酮-3标准品适量,配制标准溶液,另取其他5种标准品配制成定位溶液,即可判断15种防晒剂的位置,并测定其含量,大大减少了标准品的使用量,节约了操作时间、降低了分析成本且提高了工作效率,同时保证了测定结果的准确性。

表10 批号为140、400和78的样品分析结果Tab.10 Analytical results of samples with lot numbers 140,400 and 78 %