李 翔 范作义 王井源 王 淇 李喜鹏 王德秋孔令远 曹森林 孟庆刚 赵曦阳*

(1.林木遗传育种国家重点实验室,东北林业大学林学院,哈尔滨 150040； 2.吉林省临江林业局,临江 134600)

在生物体内，三联体密码子是由信使RNA分子中四个碱基组成3个核苷酸形成的，编码一个特定的氨基酸，进行遗传信息的传递。一般地，密码子存在简并性，即每个特定的氨基酸可对应1～6种密码子[1]。在生物的长期进化过程中，由于受到自然选择压力、变异和突变的影响，不同生物体在编码氨基酸时并不是完全随机选择密码子，而是对某些特定的同义密码子存在一定的使用偏好性，即存在密码子使用偏好性现象(codon bias)，该现象在自然界中普遍存在。目前，在细菌、哺乳动物和植物等多个物种中，均观察到明显的密码子使用偏好性现象[2]。密码子偏好性不但可以影响蛋白质翻译的速度和折叠，还可以影响mRNA水平的转录调控及外源基因的表达量[3～4]。前人研究发现，在大量组织中普遍表达且表达水平相对恒定的基因的表达量与密码子使用偏好性存在较强的相关性，这些基因受到了明显的翻译选择作用[5]。另外，不同物种、不同生物体的基因、基因家族或基因组密码子在使用上存在很大的差异，对功能基因的翻译调控产生重要的影响[6～7]，进而会影响基因的功能。即使在一个基因内，密码子的使用偏好性也会有很大的差异。因此，分析同义密码子的使用偏好性将有助于揭示物种的起源和分子进化规律，提高翻译的准确性和效率，为研究生物体进化、基因功能、蛋白质结构，提高外源基因的表达量提供了重要信息，同时，可利用编码区和非编码区的基因组特征差异进行全基因组扫描，发现新基因，对研究基因功能和蛋白质功能具有重要的参考价值[8]。

目前，关于密码子使用偏好性的研究表明，密码子偏好性是通过选择、突变和遗传漂变之间的平衡来维持的。密码子偏好性可能与3个原因有关，一是避免转录终止，影响基因表达，二是密码子与反密码子的相互作用强度适中，有利于蛋白质生物合成的迅速进行，三是密码子偏好性可提高翻译效率，增加细胞内tRNA的含量。此外，密码子偏好性受其他因素影响，如基因的碱基组成、GC含量、基因长度、表达水平、蛋白质亲水性、蛋白质二级结构、表达水平等[9]。近年来，随着高通量测序技术的快速发展，多个物种基因组测序已经完成，将有助于在全基因组水平上揭示密码子使用偏好性。目前，已在多个模式生物和非模式生物中对单基因或基因组密码子使用偏好性进行了深入的研究，如毛果杨(Populustrichocarpa)[10]水稻(Oryzasativa)[11]和苹果(Malusdomestica)[12]等。而红松(Pinuskoraiensis)基因组测序尚未完成，相关分子研究基础较为薄弱，在红松中还未见对单基因进行密码子偏好性分析的报道。

红松为松科(Pinaceae)松属(PinusLinn.)常绿针叶树，是我国东北地区珍贵的用材树种和经济林树种，具有重要的经济价值和生态价值[13～14]。其材质轻软、耐腐蚀性强，树皮富含松多酚，具有极高的开发价值。多酚是一种广泛存在于植物的根、叶、皮等器官中的一种次生代谢化合物，具有多种生理功能，可降低血脂，减缓衰老，现已在材料、食品等多个领域被广泛应用。松多酚是松科植物中特有的多酚类化合物，其含量丰富，具有抗炎镇痛、降血压等功效，科研工作者对松多酚开展了大量的研究[15]。研究发现，松多酚中含有类黄酮和花色素，使植物的花、果实等器官呈现不同的颜色[16]。关于松多酚的分子研究较为广泛，松多酚合成过程中相关功能基因很多，主要包括查尔酮合成酶(CHS)、黄酮醇合成酶(FLS)和查尔酮异构酶(CHI)等。其中，查尔酮合成酶(CHS)是植物中黄酮、花色素和异黄酮等化合物合成的关键酶之一，在多酚合成过程中发挥着重要的作用，可影响植物的花色及防御反应[17]。查尔酮合成酶基因CHS于1983年首次在荷兰芹(Petroselinumcrispum)[18]中发现，现已在多个植物中克隆得到了CHS基因，如甘薯(Pomoeabatatas)[19]、桂花(Osmanthusfragrans)[20]和樟子松(Pinussylvestris)[21]和拟南芥(Arabidopsisthaliana)[22]等。而关于CHS基因密码子偏好性的研究较少，仅有部分植物研究中有报道。前人研究发现，不同植物中的CHS密码子偏好性存在一定差异，如蓼科大黄属物种[23]和猕猴桃中CHS基因[8]最优密码子偏爱以G/C结尾，而豆科植物CHS基因[24]对A或U结尾的密码子偏好性较强。目前，关于红松CHS基因方面的报道较少[25～26]，相关功能还不清楚，开展CHS密码子偏好性分析将有助于研究该基因的遗传特征和分子机理，进而为有效利用松多酚资源奠定一定的基础。笔者从GenBank中获得红松查尔酮合成酶基因CHS序列，采用EMBOSS在线程序、MEGA7.0软件[27]和CodonW分析其密码子偏好性，运用R语言软件(version 3.5.0)[28]和SPSS(version 23.0)软件[29]统计密码子偏好性参数，为CHS基因功能和分子进化的深入研究提供理论依据。此外，将CHS的密码子偏好性与大肠杆菌、酵母、烟草和拟南芥的基因组密码子进行比较,以期为筛选该基因的理想表达系统奠定基础。

1 材料和方法

1.1 序列来源

本研究采用的红松查尔酮合成酶基因CHS编码区序列来自NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，Genbank登录号为KJ796482.1。以Chalcone Synthase为关键词从NCBI中检索并下载苹果(Malusdomestica)、北美乔松(Pinusstrobus)、大豆(Glycinemax)、猕猴桃(Actinidiachinensis)和玉米(Zeamays)等其他24种植物CHS基因的编码序列用于本研究，登录号见表1。

表1 不同植物CHS基因完整CDS编码序列

Table 1 Complete CDS sequence coding frame ofCHSgene in different plants

序号Number物种Species编号ID登陆号Accession number1红松Pinus koraiensisPkKJ796482.12甘蓝Brassica oleraceaBoHQ189776.13北美乔松Pinus strobusPsAJ004800.14碧桃Prunus persicaPpHM543568.15草莓Fragaria×ananassaFaAB201758.16大豆Glycine maxGmXM_003553938.47杜鹃花Rhododendron simsiiRsAJ413277.18柑橘Citrus sinensisCsAB009350.19高粱Sorghum bicolorSbAF15255310菊花Chrysanthemum×morifoliumCmDQ521272.111大麦Hordeum vulgareHvAY28609312猕猴桃Actinidia chinensisAcKF157394.113拟南芥Arabidopsis thalianaAtNM_121396.414苹果Malus domesticaMdAB074485.115葡萄Vitis viniferaVvNM_001281135.116水稻Oryza sativaOsAB000801.217王府海棠Malus hybridMhFJ599763.118西洋梨Pyrus communisPcDQ901397.219烟草Nicotiana tabacumNtNM_001326166.120玉米Zea maysZmNM_001148774.121赤松Pinus densiflora pdchsxPdAB01549022毛果杨Populus trichocarpaPtDQ37180423马尾松Pinus massonianaPmKF30388324辐射松Pinus radiataPrKF70481725海岸松Pinus pinasterPp1AY168850

1.2 分析方法

1.2.1 密码子偏好性参数分析

将25种植物的CDS序列整理后，利用分析平台Galaxy(version 1.4.4)(https://galaxy.pasteur.fr/)中的CodonW模块和EMBOSS在线软件(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)的CUSP模块与CHIPS模块对CHS进行密码子偏好性参数分析，包括同义密码子相对使用度(RSCU)、密码子适应指数(CAI)、有效密码子数(ENC)、密码子G和C总含量(GC)、密码子末位碱基G或C的含量(GC3s)和密码子使用频率(frequency)等。从Condo Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)数据库中获得模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)、酵母(Saccharomycescerevisiae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和烟草(Nicotianasylvestris)基因组的密码子使用频率数据。

RSCU是指某些特定密码子在同义密码子中的相对概率，一般地，RSCU值大于1，表示该密码子使用偏好性强，而RSCU值小于1，表示无使用偏好性[10]。ENC值可反映所有密码子中同义密码子使用偏好程度，其分布范围为20～61，该值是反应密码子使用偏离随机选择的程度。ENC值越靠近20，该基因的密码子偏好性越强，而越靠近61，偏好性越弱[30]。CAI值范围为0～1，该值越接近1，表明该基因的偏好性越强，而越接近0，则偏好性越弱[31]。密码子的第3位碱基中G+C的含量与第3位碱基总量的比值即GC3s。GC含量是指目的序列中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率。

1.2.2 聚类分析

基于密码子使用偏好性的聚类分析是以不同物种的简并密码子(去除终止密码子TAA、TAG和TGA，起始密码子ATG和甲硫氨酸TGG)的RSCU值为变量，采用R语言中的pheatmap包(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)绘制系统聚类热图。基于CDS编码区序列的聚类分析是采用MEGA7.0(Neighbour-Joining,NJ)构建的系统发育树，并利用在线软件绘图工具iTOL(Interactive Tree Of Life，https://itol.embl.de/)对进化树进行可视化展示。

2 结果分析

2.1 红松CHS密码子使用偏好性分析

对红松CHS基因使用频率和RSCU值统计发现(详见表2)，61个密码子中使用频率最大的是AAG和GAG(45.34%)，26个密码子RSCU值大于1，是红松CHS基因的偏好密码子。GCC、TTC、GGA、ATC、CCC、AGA、AGT、CTC、CTG、TAC共10个密码子的RSCU值大于1.5，表明是该基因的高频率密码子，其中GGA(2.06)、CCC(2.48)、AGA(2.47)、CTG(2.31)这4个密码子的RACU值均大于2，表明该基因对这些密码子具有极强的偏好性。我们发现，编码Leu的CTA的RSCU值为0，说明该密码子可能不参与红松CHS基因的翻译过程。此外，红松中NTA型密码子(GTA:0.38,ATA:0.33,TTA:0.15,CTA:0)的RSCU值较低，这可能有利于mRNA的降解以提高蛋白含量，NCG型的密码子RSCU值(CCG:0.19,GCG:0.48,TCG:1.43,ACG:0.50)较低，表明红松可能是一种甲基化程度较高的植物。

表2 红松CHS基因同义密码子相对使用度

注：下划线表示红松CHS基因该密码子使用频率较高

Note：The underlines mean codon usage with high frequency inCHSofP.koraiensis

表3 物种间CHS密码子偏好性分析

图1 基于密码子使用频率的聚类分析 *表示RSCU值大于1的密码子Fig.1 Cluster analysis heatmap of codon usage frequency * means the RSCU value is more than 1

图2 25种植物CHS基因的聚类树状图 ★代表被研究的物种Fig.2 Cluster dendrogram of CHS gene from 25 plant species ★ represents the species studied

根据密码子偏好性参数分析结果(详见表3)，发现红松CHS基因编码区的ENC值为48.92，远离20，更接近61，表明该基因的密码子使用偏好性较弱，蛋白质的表达量可能偏低；CAI值为0.762，表明其密码子偏好性一般；红松CHS基因编码区的GC含量为0.548，略大于0.5，而GC3s值是0.351，小于0.5，表明红松CHS基因在碱基利用时，更倾向于C+G，对以A/T结尾的密码子偏好性较强。

2.2 物种间CHS密码子使用偏好性比较

25种植物的GC3s、GC含量、CAI值、RSCU值和ENC值如表3所示。25个物种的ENC平均值为50.29，最小的是玉米(29.05)，表达水平较高，最大的是柑橘(58.89)，表达水平较低。进一步分析ENC值发现，多数植物CHS基因的ENC值均大于35.0，表明多数植物CHS基因的密码子偏好性较弱，而禾本科植物CHS基因的ENC值均小于35(除高粱外)，表明禾本科植物CHS基因具有更强的密码子偏好性。25个物种CHS基因的CAI值介于0.647～0.762，平均值为0.729，表明密码子选择偏好性一般。对GC含量研究发现，GC含量范围为0.473～0.984，平均值为0.632，其中22个物种的GC含量均大于0.5，而GC3s值大于0.5的物种也有22个，表明不同物种CHS密码子选择偏好性存在差异，多数物种的G+C含量高于A+T含量，且密码子更偏好C/G结尾。通过RSCU值对25个物种CHS密码子使用偏好性分析，结果表明，菊花RSCU>1的密码子数目最多为31个，高粱、拟南芥、赤松、辐射松最少为23个；水稻RSCU>1.5的密码子最多达23个，海岸松最少有7个。同时，禾本科植物RSCU>1.5的密码子数目要比其他植物多，表明禾本科植物密码子使用偏好性比其他植物强，与基于ENC的分析结果相同。除毛果杨外，其他24种植物共同偏好使用的密码子是CTC，该密码子在禾本科植物CHS基因中使用偏好性明显较其他植物强(见图1)。

2.3 CHS基因密码子使用偏好性和CDS序列的系统聚类分析

对25种植物的CHS基因密码子使用偏好性进行聚类分析(见图1)。结果表明，25个物种CHS分为2大类，样本数分别为4和21，其中禾本科植物聚成一大类(水稻、高粱、玉米、大麦)，剩余的植物聚为一大类，说明它们之间的密码子偏好性存在明显的差异，其他分支又分为许多小的聚类中心。其中同属于松科的马尾松、赤松和红松的CHS基因聚在一个小支上，辐射松、海岸松和北美乔松聚在另一个小支上，这两个小支共聚在一个大支上面，表明具有相近亲缘关系的物种在密码子使用模式上较为相似。进一步分析发现，同属蔷薇科的王府海棠、西洋梨和苹果也聚在一个小支上，碧桃和草莓聚在一个小支上，这两个小支共聚在一个大支上面，说明基于RSCU值的聚类结果与传统分类学很相近。而毛果杨、拟南芥和猕猴桃各单独成为一个小分类，说明毛果杨、拟南芥和猕猴桃的CHS基因在密码子使用上与其他植物存在差异。同时，拟南芥和红松聚在一个大支上，一定程度上说明拟南芥作为受体植物研究红松CHS基因更具有优势。此外，不是同一科的烟草、菊花和柑橘聚在一个小支上，说明它们的CHS基因在密码子使用偏好性上较为相似。因此，RSCU值是研究植物进化关系一个很好的参数。对25种植物的CHS基因密码子使用频率统计发现，61个密码子可分为4大类，其中CTC密码子在所有物种中均出现，其在单子叶植物中的使用频率明显高于双子叶植物。值得注意的是，AGA、GGA、GGT和TCT等密码子仅在部分双子叶植物中使用频率较高，而在单子叶中使用频率较低，甚至不会出现。运用MEGA7.0将不同物种的CDS序列进行聚类分析，进一步分析红松CHS基因与其他物种间的亲缘关系，结果发现(见图2)禾本科4种植物的CDS序列同源性较高，聚在一个大的分支上，这一聚类结果与基于RSCU值的聚类分析结果相似，但此时水稻和大麦没有聚在一个小分支上。另外，从图中可看出红松、赤松、海岸松、北美乔松、马尾松和辐射松等6种松科植物均聚在一个大支上，这一结果与基于RSCU值的聚类结果一致，其中红松CHS基因的CDS序列与北美乔松和海岸松的同源性较高。基于RSCU值聚类结果在一定程度上可反映红松的进化规律，但基于CDS序列的聚类结果与普通分类学结果更接近。

2.4 红松CHS受体系统选择

密码子使用频率的比值大小是评价不同物种间密码子使用偏好性的重要参数，当该值≤0.5或≥2时，表示两个物种间密码子使用偏好性差异较大，反之密码子使用较为一致。将红松CHS密码子使用频率与烟草、大肠杆菌、拟南芥和酵母进行比较分析(见表4)。由表4可知，红松CHS与烟草、大肠杆菌、拟南芥和酵母基因组中使用偏好性差异较大的密码子分别有31、31、28和34个，大肠杆菌、酵母菌密的码子使用频率差异较小，其中大肠杆菌表达系统更适用于红松CHS的异源表达，拟南芥可能为CHS基因遗传转化试验最佳的受体材料。

表4 红松CHS基因与部分模式植物基因组密码子使用偏好性比较

Table 4 Comparison of codon usage preference betweenCHSgene inP.koraiensisand the other representative organisms

密码子Condon氨基酸Amino acidPkScEcNsAtPk/ScPk/EcPk/NsPk/AtGCAA17.616.22322.917.51.090.7670.771.01GCCA32.712.621.612.910.32.601.5162.543.18GCGA10.16.221.14.791.630.4782.141.12GCTA22.721.218.934.528.31.071.1990.660.80TGCC15.14.85.57.57.23.152.7482.022.10TGTC5.08.15.98.710.50.620.8540.580.48GACD35.320.217.916.217.21.751.9702.182.05GATD22.737.633.735.636.60.600.6730.640.62GAAE15.145.635.135.834.30.330.4310.420.44GAGE45.319.219.427.932.22.362.3371.631.41TTCF32.718.413.917.420.71.782.3561.881.58TTTF5.026.124.423.621.80.190.2060.210.23GGAG42.810.913.626.224.23.933.1491.631.77GGCG25.29.820.614.39.22.571.2231.762.74GGGG5.06.012.311.210.20.840.4100.450.49GGTG10.123.923.731.622.20.420.4250.320.45CACH12.67.87.38.78.71.611.7251.451.45CATH5.013.612.410.813.80.370.4060.470.37ATAI5.017.813.310.612.60.280.3790.480.40ATCI30.217.219.413.918.51.761.5582.171.63ATTI10.130.129.626.121.50.330.3400.390.47AAAK17.641.937.228.430.80.420.4740.620.57AAGK45.330.815.332.432.71.472.9631.401.39CTAL0.013.45.67.19.90.000.0000.000.00CTCL30.25.49.511.916.15.603.1822.541.88CTGL37.810.537.47.49.83.601.0105.113.86CTTL15.112.314.525.424.11.231.0420.600.63TTAL2.526.217.412.012.70.100.1450.210.20TTGL12.627.212.923.320.90.460.9760.540.60ATGM32.720.923.724.224.51.571.3821.351.34AACN15.124.820.316.920.90.610.7440.890.72AATN12.635.729.322.722.30.350.4300.550.56CCAP7.618.39.123.516.10.410.8300.320.47CCCP32.76.86.26.95.34.825.2824.756.18CCGP2.55.314.54.88.60.480.1740.520.29CCTP10.113.59.520.818.70.751.0610.480.54CAAQ12.627.314.421.519.40.460.8750.590.65CAGQ35.312.126.716.415.22.911.3212.152.32AGAR17.621.37.116.719.00.832.4831.060.93AGGR10.19.24.013.811.01.102.5190.730.92CGAR0.03.04.84.26.30.000.0000.000.00CGCR5.02.614.04.93.81.940.3601.031.33CGGR7.61.77.94.74.94.450.9571.611.54CGTR2.56.415.910.79.00.390.1580.240.28AGCS12.69.814.39.811.31.290.8811.291.11AGTS15.114.213.212.114.01.061.1451.251.08TCAS0.018.713.114.618.30.000.0000.000.00TCCS10.114.29.711.011.20.711.0390.920.90TCGS12.68.68.23.39.31.461.5363.821.35TCTS2.523.513.121.925.20.110.1920.120.10ACAT15.117.815.115.515.70.851.0010.980.96ACCT17.612.718.910.610.31.390.9331.661.71ACGT7.68.013.63.77.70.940.5562.040.98ACTT20.220.313.121.017.50.991.5380.961.15GTAV7.611.813.111.19.90.640.5770.680.76GTCV30.211.813.111.112.82.562.3072.722.36GTGV22.710.819.917.417.42.101.1391.301.30GTTV20.222.121.628.427.20.910.9330.710.74TGGW10.110.413.412.612.50.970.7520.800.81TACY17.614.811.714.913.71.191.5071.181.29TATY5.018.821.616.914.60.270.2330.300.35TAA*2.51.12.00.70.92.291.2603.602.80TAG*0.00.50.30.50.50.000.0000.000.00TGA*0.00.71.11.21.20.000.0000.000.00

3 讨论

同义密码子由于存在简并性，往往不会影响氨基酸的编码，进而不会改变蛋白质的结构功能，因此，不会对细胞功能产生严重的影响。但是，经过长期的进化，有些密码子在基因或测序基因组中比其他密码子出现得更频繁，密码子偏好性是广泛存在且在部分物种中是非常强烈的，将特定的密码子进行的同义突变处理，可使目的基因的表达量显著提高[32]，在提高外源基因转化效率方面具有重要的作用。

密码子使用偏好性是物种在漫长的自然选择和进化进程中形成的适应性选择，对研究基因的进化和功能鉴定具有重要的意义。然而，红松中相关研究还未见报道。本研究通过对红松CHS基因密码子使用模式进行分析，确定了GCC、TTC、GGA、ATC、CCC、AGA、AGT、CTC、CTG、TAC共10个密码子是该基因的高频率密码子，其中GGA、CCC、AGA、CTG这4个密码子具有极强的偏好性，可作为该基因的最优密码子，同时也存在CTA、CGA和TCA等不参与该基因编码过程的密码子，说明红松CHS进化过程可能较为复杂。红松CHS与赤松、马尾松、海岸松、北美乔松和辐射松的ENC值均大于48，可见松科植物的密码子使用偏好性相对较弱，对密码子的选择具有较高的随机性。先前的研究发现，单子叶植物基因偏向于C/G结尾的密码子，双子叶植物基因偏向于A/T结尾的密码子[33]，而在裸子植物中还没有相关的结论。本研究表明，在基因密码子碱基选择时，红松CHS基因编码区GC3s含量小于0.5，更偏好于A/T结尾的密码子，这可能是由于红松在进化过程中主要以GC到AT突变方向为主有关，而松科的其他几个物种的GC3s含量均大于0.5，AT到GC的突变压力要比GC到AT的突变压力大，说明红松存在特殊的密码子使用模式和进化形式。此外，4个NTA和NCG型密码子的RSCU值较低，说明红松的甲基化程度可能较高。

研究表明，基因的密码子使用特性在不同物种之间可能存在明显差异，但在亲缘关系较近的物种之间差异较小，反之差异较大[34]。基于密码子使用偏好性和基于CDS序列的聚类分析结果存在着一定的差异，这与前人的研究结果一致[35]。而将两种方法相结合可在一定程度上客观反应出物种的进化规律，其中基于CDS序列的聚类分析更能反映出系统分类学中物种间的亲缘关系。本研究表明红松与赤松、海岸松、北美乔松、马尾松和辐射松等6种松科植物在两种聚类方式中均聚在一个大支上，同属蔷薇科的王府海棠、西洋梨、苹果、碧桃和草莓也聚在一个大支上，进一步说明亲缘关系较近的物种一般具有相似的密码子使用偏好性，这与在大豆(Glycinemax)[24]、籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)[36]、小麦(Triticumaestivum)[37]等植物中的研究结果一致。研究中发现禾本科4种植物的CDS序列同源性较高，这一聚类结果与基于RSCU值的聚类分析结果相似，但在更小的分类单元上，水稻和大麦没有聚在一个小分支上，这可能是由于在物种进化过程中由于发生突变而造成CHS基因密码子使用偏好性存在差异。

在基因工程研究中，外源目的基因在受体细胞中的表达效率常与外源基因的结构密切相关，其中外源目的基因与模式物种基因组密码子使用偏好性是一个重要的指标，尤其是稀有密码子，可在一定程度上影响外源基因的转化、转录表达水平及相应功能[38]。本研究表明，拟南芥和大肠杆菌可能作为红松CHS遗传转化和异源表达较为理想的受体，这与陈义挺等[10]对猕猴桃的研究结论一致。通过遗传转化技术改良林木品质是一种强有力的方法，可对CHS基因的部分密码子进行特殊优化和定向改造，以期获得稳定高效表达的遗传转化体系。随着测序技术的不断发展，越来越多的林木完成了全基因测序，为林木基因工程的开展和遗传改良奠定了基础。今后，根据林木CHS基因或基因家族的密码子使用偏好性特征，在全基因组水平上进行相应的遗传改造，不仅能有效促进类黄酮类物质的合成，还对林木花色、抗逆性、转基因育种、基因家族起源及基因复制的研究具有巨大的理论意义。