李永盛，王茂鹤，刘建飞，邸多隆，刘晔玮，魏鉴腾*

1兰州大学公共卫生学院 营养与食品卫生学研究所；2中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室；3甘肃中医药大学药学院，兰州 730000

宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)多年生落叶灌木，其果实(枸杞子)作为常用的药食同源品种被列入“药食同源物品目录”[1,2]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBPs)是从枸杞子中提取分离得到的一类活性多糖，现代医学研究表明：LBPs具有抗氧化、预防和修复肝细胞损伤、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎等多种药理和生理活性，在预防和治疗各种慢性疾病方面发挥着重要的作用[3]。同时，LBPs已被证明在多种肝损伤模型中具有保护作用，如CCl4诱导的化学性肝损伤[4]、药物性肝损伤[5]、酒精性肝损伤[6]以及非酒精性脂肪肝[7]。

近年来的研究表明，LBPs是一组水溶性糖复合物，其种类繁多，结构复杂，含量约占干果总重量的5%～8%，其分子量范围为2～241 kDa[8]。影响LBPs活性的因素很多，其中分子量是重要因素之一。如Zhang等[9]利用膜分离技术分离得到的平均分子量为10.2 kDa的LBPs-a4表现出抑制SMMC-7721细胞增殖的活性，但平均分子量为6.50×103kDa的LBPs-p8的作用相反，其认为分子量是影响LBPs凋亡诱导活性的关键因素。Tang等[10]利用膜分离技术分离得到两种不同分子量范围LBPs，其中平均分子量为4.92 kDa的LBPs具有降糖活性。目前，LBPs保护乙醇诱导肝损伤活性的最佳分子量范围没有明确报道，因此，我们通过体外培养人正常肝细胞(L-02细胞)建立乙醇诱导肝细胞损伤模型，研究不同分子量范围LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用，得出LBPs最佳分子量范围，研究结果可为LBPs保肝功能食品及药物的应用开发提供实验基础和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中所用样品为2017年采自我国宁夏中宁产区的宁杞Ⅰ号枸杞，经鉴定为宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实。LBPs由中科院西北特色植物资源化学重点实验室制备，采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[11]。称取枸杞粉末200.00 g，以料液比1∶12(g/g)在60 ℃下高速剪切1 h(8 000 rpm)，抽滤后70%醇沉，经冷冻干燥得粗多糖(LBPs0)，其含量(得率)为65.19%(8.92%)。LBPs0经水溶解、膜过滤、冷冻干燥得分子量截留值(MWCO)分别为30、10、5、2 kDa的不同分子量范围LBPs(LBPs1、LBPs2、LBPs3、LBPs4)，其含量(得率)依次为74.90%(28.65%)、56.18%(21.55%)、62.42%(25.22%)、59.30%(16.75%)。

1.2 试剂与仪器

Hyclone RPMI 1640培养基(美国Thermo Fisher公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；无水乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；二甲基亚砜、噻唑蓝(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒和活性氧(ROS)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；谷丙转氨酶(ALT)测试盒和谷草转氨酶(AST)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

CCL-170T-8型ESCO CelCulture 二氧化碳恒温培养箱(新加坡ESCO公司)；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；XD-30A型倒置生物显微镜(舜宇光学科技(集团)有限公司)；XL-12K型微量离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)；DNM-9602G型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；TU-1901双光束紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；FLUOROMAX-4P瞬态荧光光谱仪(日本HORIBA集团)；FV1200型激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus集团)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将人正常肝细胞(L-02细胞)培养于含10%FBS、1%青-链霉素混合溶液的RPMI-1640培养基中，在含有5% CO2的37 ℃恒温加湿培养箱中培养。

1.3.2 乙醇诱导肝细胞损伤模型的构建和LBPs对肝细胞活力的影响

用MTT法筛选乙醇损伤浓度以构建乙醇诱导肝细胞损伤模型，并考察不同分子量范围LBPs对肝细胞活力的影响，乙醇和LBPs处理时间分别设定为4和24 h[12]。取对数生长期的L-02细胞，接种于96孔板中(5×103个细胞/200 μL/孔)，37 ℃孵育24 h。吸弃原有培养基，分别加入含不同浓度乙醇(0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%(V/V))的培养基培养4 h、分别加入含不同浓度不同分子量范围LBPs(12.5、25、50、100、200 μg/mL)的培养基培养24h，每组设6个复孔。加入MTT溶液(5 mg/mL，20 μL/孔)，继续培养3.5 h。吸弃原培养基，加入二甲基亚砜(DMSO，150 μL/孔)，震荡10 min，待结晶物完全融解后，用酶标仪在495 nm处测定各孔吸光度(absorbance，A)，细胞活力计算公式：

1.3.3 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞活力的影响

取对数生长期的L-02细胞，接种于96孔板中(5×103个细胞/200 μL/孔)，37 ℃孵育24 h。实验设立正常对照组，乙醇损伤组，LBPs保护组，每组设6个复孔。吸弃原培养基，正常对照组加入新鲜培养基，乙醇损伤组和LBPs保护组加入含适当浓度乙醇的培养基，培养4 h。吸弃培养基，对照组和乙醇损伤组加入新鲜培养基，LBPs保护组加入含不同浓度不同分子量范围LBPs的培养基，培养24 h。用MTT法测定细胞活力。

1.3.4 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞培养液中ALT、AST和LDH释放的影响

为评价LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞中酶释放的影响程度，测定不同分子量范围LBPs干预后培养细胞上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的酶活力[6]。取对数生长期的L-02细胞接种于12孔板中(2.4×105个细胞/2 mL/孔)，每组设3个复孔，分组及干预方法同“1.3.3”，取培养细胞上清液待测。严格按ALT、AST和LDH测定试剂盒说明书操作，根据标准曲线计算各组转氨酶活力。

1.3.5 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞内活性氧水平的影响

定性和定量检测LBPs干预后细胞内活性氧(ROS)水平的变化，观察不同分子量范围LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞内ROS水平的影响[12]。取对数生长期的L-02细胞接种于预先放置有φ20 mm细胞爬片的12孔板中，每组设3个复孔，分组及干预条件同“1.3.3”。装载荧光探针：吸弃培养基后，各组加入1 mL含10 μmol/L DCFH-DA 探针的无血清培养基，孵育20 min后，用PBS洗涤细胞三次。在激发波长488 nm和发射波长525 nm条件下，用激光扫描共聚焦荧光显微镜定性观察各组细胞内荧光水平，用荧光光谱仪定量检测细胞内荧光强度，即ROS水平。

1.3.6 数据分析

利用IBM SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，使用Dunnett检验和Tukey检验进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 乙醇诱导肝细胞损伤模型的构建和LBPs对肝细胞活力的影响

如图1(A)所示，细胞活力随乙醇浓度升高而逐渐降低，具有剂量依赖性。当乙醇损伤浓度为5%时，细胞活力为79.46%±2.95%，显著低于浓度为0%时的细胞活力(P<0.01)，选择5%乙醇损伤细胞4 h构建乙醇诱导肝损伤模型。如图1(B)所示，LBPs浓度在(0～200)μg/mL间的细胞活力无显著性差异(P>0.05)，可知不同分子量范围LBPs均对细胞增殖没有抑制和促进作用。

图1 乙醇和LBPs对肝细胞活力的影响

2.2 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞活力的影响

如图2所示，与对照组相比，乙醇损伤组细胞活力显著降低(P<0.01)，细胞活力为72.02%±3.80%。与乙醇损伤组相比，当LBPs浓度在25～100 μg/mL时，LBPs0、LBPs2、LBPs3、LBPs4保护组的细胞活力均显著高于乙醇损伤组(P<0.05)，在LBPs0 12.5～100 μg/mL、LBPs2 12.5～50 μg/mL、LBPs3 12.5～100 μg/mL、LBPs4 12.5～200 μg/mL时的细胞活力随浓度增加而升高；LBPs1浓度在12.5～200 μg/mL间的细胞活力均与乙醇损伤组相比无统计学差异(P>0.05)，且均低于其他分子量范围LBPs。除LBPs1外，不同分子量范围LBPs均在较低浓度(25 μg/mL)时即产生保护作用，故选取25 μg/mL LBPs作用24 h进行后续酶活力和细胞内ROS水平测定。此外，由两两比较结果可知，LBPs3保护组在不同浓度下的细胞活力均高于其他LBPs保护组。以上结果提示不同分子量范围LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞活力的保护作用不同，LBPs3的保护作用最强。

图2 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞活力的影响

2.3 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞培养液中ALT、AST和LDH释放的影响

细胞培养液中ALT、AST和LDH酶活力水平测定结果见图3(A、B、C)，乙醇损伤组细胞培养液中ALT、AST和LDH酶活力水平显著高于正常对照组(P<0.01)，分别为正常对照组的3.10、3.25和1.86倍。经25 μg/mL LBPs处理后，细胞培养液中ALT、AST和LDH酶活力水平均显著低于乙醇损伤组(P<0.05)，其中LBPs3保护组酶活力最低，分别为乙醇损伤组的0.50、0.42和0.67倍。结果表明，乙醇可使细胞膜受损而使胞内大量的酶释放入细胞培养液，不同分子量范围LBPs均可修复由乙醇引起胞内酶的释放，LBPs3的修复作用最强。

图3 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞培养液中ALT(A)、AST(B)和LDH(C)释放的影响

图4 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞内ROS水平的影响

2.4 LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤细胞内ROS水平的影响

由图4(A-I)可见，乙醇损伤组荧光强度较正常对照组明显升高，而LBPs1、LBPs2、LBPs3、LBPs4组明显低于乙醇损伤组。由图4(A-III)和图4(B)可知，与正常对照组相比，乙醇损伤组的荧光强度显著升高(P<0.01)，与乙醇损伤组相比，LBPs1、LBPs2、LBPs3和LBPs4保护组的荧光强度值显著降低(P<0.05)，分别较乙醇损伤组降低了17.11%、24.64%、34.87%、17.59%。结果表明，不同分子量范围LBPs均对乙醇诱导的细胞内ROS水平升高有显著的抑制作用，LBPs3的抑制作用最强。

3 讨论与结论

本研究利用MTT法对不同浓度不同分子量范围LBPs的乙醇诱导肝损伤保护活性进行初步筛选，结果发现LBPs0、LBPs2、LBPs3、LBPs4对乙醇诱导肝细胞损伤的细胞活力随浓度增加而增高，且在较低浓度25 μg/mL时即具有保护作用，与Zhang[12]的研究一致，故使用25 μg/mL LBPs作为干预条件进行后续研究。

诸多研究[13,14]证实乙醇诱导的肝损伤依赖于ROS的生成，线粒体产生过量的ROS介导了氧化应激、细胞功能丧失并最终导致细胞凋亡或坏死。过量的ROS能促使细胞发生脂质过氧化使细胞器膜或细胞膜受损，从而使胞内酶类(如转氨酶等)释放到细胞外[15]，肝转氨酶的释放水平与肝细胞损伤程度有密切联系，其释放是肝细胞受损的主要敏感指标[16]；过量的ROS还可损伤线粒体本身，从而介导线粒体凋亡途径，细胞内LDH则响应凋亡信号从细胞中释放出来，LDH的释放是细胞凋亡的主要指标[17]。LBPs是枸杞子主要的活性成分之一，大量研究发现LBPs具有抗氧化活性[3,18]。本研究表明，LBPs主要通过以下三方面作用发挥保护作用：扭转乙醇诱导的肝细胞活力降低；防止乙醇对肝细胞膜的损伤作用而使ALT、AST、LDH的释放降低；抑制乙醇所致肝细胞内ROS的产生。本研究发现LBPs可显著降低乙醇诱导的肝细胞ROS水平，推测LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用是通过抑制氧化应激而发挥的，与Xiao等[7]和Varoni等[5]的研究一致，后期应结合LBPs的单糖组成、糖苷键和功能基团等结构特征深入探讨其抗氧化应激的分子机制。

近年的研究发现，多糖的生物活性与单糖组成、连接方式、分子量和构象等结构特征有关，分子量对生物活性的影响显著且复杂[19,20]。研究显示，不同来源多糖其最佳活性的分子量范围不同：Deng等[11]利用膜分离技术分离得到5种LBPs，经动物实验发现5种LBPs均对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用，且分子量范围为40～350 kDa的LBPs3具有最佳活性；分子量范围为15.2～40.1 kDa的黄芪多糖具有显著的免疫活性[21]，平均分子量为6.53 kDa的紫球藻多糖的免疫调节活性和及抗肿瘤活性最强[22]，平均分子量为306.2 kDa的香菇多糖具有最强的体内抗氧化活性[23]，平均分子量为5.5 kDa的红景天多糖的抗氧化活性及保肝活性比425.7 kDa的红景天多糖更强[24]。本研究发现不同分子量范围LBPs有不同程度的肝保护活性：分子量范围为5～10 kDa的LBPs3的肝保护活性最强，其多糖含量和得率高(仅次于LBPs1，均高于LBPs4和LBPs2)；分子量范围分别为2～5 kDa和10～30 kDa的LBPs4和LBPs2的肝保护活性次之(二者的多糖含量和得率低)；分子量范围为>30 kDa的LBPs1肝保护活性最弱。高分子量范围LBPs活性低，可能是由于其具有较高的表观粘度和较差的水溶性，难以通过生物膜屏障和进入生物体细胞内发挥其功能，但其分子量范围过低，则难以形成有活性的聚合物构象[23]，本研究提示分子量范围适中的LBPs3具有较高的开发利用价值，结果与Minjares和You等[23,25]的报道一致。

本研究表明：LBPs在0～200μg/mL间对肝细胞增殖无抑制或促进作用，其可通过提高细胞活力，降低ALT、AST、LDH的释放和抑制细胞内ROS的产生而发挥对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用。不同分子量范围LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护活性不同，分子量范围为5～10 kDa的LBPs3最强，其次为2～5 kDa的LBPs4和10～30 kDa的LBPs2，>30 kDa的LBPs1最弱。本实验结果可为LBPs保护肝细胞损伤功能食品及药物的应用开发提供实验基础和理论指导。