李金鑫，张京华，陈 达，李利芬，孟兆青

（山东宏济堂制药股份集团有限公司，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南250100）

喉症丸为水丸，由板蓝根、人工牛黄、冰片、猪胆汁、玄明粉、青黛、雄黄、硼砂（煅）、蟾酥（酒制）、百草霜10 味药材组成［1］，用于治疗咽炎、喉炎、扁桃腺炎、一般疮疖。目前该方执行卫生部药品标准中药成方制剂第四册质量标准（WS3-B-0848-91），但缺少含有量测定和溶出度检查项，无法以标志成分含有量变化为指标来评判泛制法改为塑制法时，是否会对产品质量产生影响。蟾酥作为喉症丸毒性药材，其所含成分的量与制剂有效性和安全性密切相关［2］。为了对喉症丸生产工艺泛制法改为塑制法进行可行性评价，本实验测定蟾酥中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出度，比较2 种工艺溶出曲线相似性，对所得样品进行一致性评价，以期为企业优化相关生产提供质量控制的方法和依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agileht 公司）；XS105 电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］；ZRS-8G 智能溶出试验仪 （天津天大天发科技有限公司）；Agilent ZORBAX-RP （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色谱柱。

1.2 试剂与药物 华蟾酥毒基（批号110803-201406，纯度99.6%）、脂蟾毒配基（批号110718-201108，纯度98.9%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。喉症丸由山东宏济堂制药集团股份有限公司生产，共6 批，其中批号1709001、1709002、1709003 为泛制丸，批号ZS1803003、ZS1803004、ZS1803005 为塑制丸。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自德国默克公司；磷酸为色谱纯，购自天津光复化学试剂有限公司；甲醇为分析纯，购自天津富宇化工有限公司；盐酸、醋酸钠、冰醋酸、氯化钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS） 均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶出度测定

2.1.1 色谱条件 填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；流动相乙腈-0.2% 磷酸 （46 ∶ 54）；体积流量1.0 mL／min；柱温23 ℃；检测波长296 nm；进样量20 μL （进样量10 μL 时响应值较小，故选择20 μL）。理论塔板数按华蟾酥毒基峰计算，应不低于5 000。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品华蟾酥毒基11.07 mg、脂蟾毒配基10.11 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，即得（母液中含华蟾酥毒基0.441 0 mg／mL、脂蟾毒配基0.400 0 mg／mL）。

2.1.3 供试品溶液制备 将适量本品研细，取约0.090 0 g （相当于20 粒质量） 于锥形瓶中，精密称定，加入100 mL 水，超声提取60 min，放冷，补重，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适应性考察 取空白溶剂、对照品（取“2.1.2” 项下母液适量，加水稀释成含华蟾酥毒基 1.107 0 μg／mL、脂蟾毒配基0.809 9 μg／mL）、供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基分离度均大于1.5，空白溶剂无干扰，表明该方法系统适应性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of various constituents

2.1.5 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下华蟾酥毒基对照品溶液25、125、250、500、1 000 μL 于100 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过；分别精密量取“2.1.2” 项下脂蟾毒配基对照 品溶液 12.5、62.5、125、250、500、1 000 μL于100 mL 量瓶中，0.2%SDS 溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，在“2.1.1” 项色谱条件下各进样20 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程分别为华蟾酥毒基Y＝13.557X+0.430 5 （r＝0.999 7）、脂蟾毒配基Y＝14.958X+0.059 5 （r＝0.999 8），分别在0.11～4.43、0.05～4.00 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 取同一供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.52%、0.35%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、18、24 h，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.74%、0.69%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 按“2.1.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.35%、0.69%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取同一批含有量已知的丸剂粉末（批号1709003） 约0.045 0 g （相当于10 粒质量），精密称定，加入一定量对照品溶液，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基平均加样回收率分别为96.31%、95.16%，RSD 分别为1.64%、1.45%。

2.2 溶出方法筛选 每粒喉症丸含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基总量很低，仅为14.29 μg。在一般制剂溶出度的测定方法中，溶出介质量为100～900 mL，但最终测定溶液质量浓度仅约为0.016 0 μg／mL，达不到定量限，故选择每天最大服用量（20 丸），此时溶出介质量为100 mL，按照2015 年版《中国药典》 四部溶出度测定法第三法（小杯法） 来测定溶出度。

2.3 溶出介质制备

2.3.1 水 纯化水。

2.3.2 pH 6.8 磷酸盐缓冲液 取0.2 mol／L 磷酸二氢 钾250 mL，加0.2 mol／L 氢氧化 钠溶液118 mL，加水稀释至1 000 mL，摇匀，即得［3］。

2.3.3 0.2%、0.5%、1.0%SDS 溶液 分别称取SDS 2、5、10 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，摇匀，即得。

2.4 样品溶液制备 以“2.3” 项下溶出介质为溶剂，体积100 mL，转速75 r／min，待其温度恒定在（37±0.5）℃后取20 粒丸剂，于5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 min，各 取2 mL 溶 液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。取样至滤过应在30 s内完成［4］，并补加同体积、同温度溶出介质。

2.5 溶出介质筛选 另取丸剂适量，研细，取约0.090 0 g （相当于20 粒的质量），精密称定，置于锥形瓶中，加入 “2.3” 项下溶出介质各100 mL，超声处理60 min，放冷，溶出介质补足减失的质量，取续滤液；精密移取“2.1.2” 项下母液，用对应溶出介质稀释成含华蟾酥毒基1.107 0 μg／mL、脂蟾毒配基0.809 9 μg／mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图2～3。由此可知，溶出介质为0.2% SDS 溶液时溶出效果较好，120 min 内溶出度均达到80%以上。

图2 华蟾酥毒基在5 种溶出介质中的的溶出曲线Fig.2 Dissolution curves for cinobufagin in five dissolution media

图3 脂蟾毒配基在5 种介质中的溶出曲线Fig.3 Dissolution curves for resibufogenin in five dissolution media

2.6 溶出度测定 取泛制法（1709001、1709002、1709003）、塑制法 （ZS1803003、ZS1803004、ZS1803005） 所得样品各3 批，以0.2% SDS 溶液为溶出介质，在 “2.1.1” 项色谱条件下，按“2.5” 项下方法测定，结果见表1，可知均符合根据溶出曲线类型和溶出情况所拟订的限度（120 min 内华蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出度都应不少于75%）。

表1 各成分溶出度测定结果（120 min）Tab.1 Results of dissolution rate determination of various constituents （120 min）

根据相关规定［4］，溶出曲线相似性的比较采用非模型依赖法中的差异因子（f1）、相似因子（f2） 法，其中前者计算2 条溶出曲线在每1 个时间点的差异，后者衡量2 条溶出曲线的相似度［5］。一般情况下，当2 条溶出曲线f1小于15，f2不小于50 时，可认为两者相似［6］。

本实验在5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 min 取样后进行测定，绘制溶出曲线，分析相似性，结果见图4～5、表2～3，由此可知，塑制丸所得3 批产品f1均小于15，f2均大于50，表明该工艺溶出曲线与泛制丸相似。

图4 塑制丸中华蟾酥毒基溶出曲线Fig.4 Dissolution curves for cinobufagin in plastic-made pills

图5 塑制丸中脂蟾毒配基溶出曲线Fig.5 Dissolution curves for resibufogenin in plasticmade pills

3 讨论

华蟾酥毒基、脂蟾毒配基是喉症丸中蟾酥主要有效成分，与该方临床疗效确切相关。因此，本实验选择上述2 种成分作为指标进行溶出度研究，能客观真实地反映喉症丸质量和溶出情况，并为相关应用提供参考。

本实验在筛选溶出介质时，分别考察了喉症丸在0.1 mol／L 盐酸、pH 4.5 醋酸盐缓冲液中的溶出情况，发现华蟾酥毒基、脂蟾毒配基在这2 种溶剂体系下均不稳定，含有量会随时间延长而减小，无法有效测定，故未绘制溶出曲线［7-8］。溶出曲线结果显示，在120、150 min 时连续2 个取样点的溶出量达到90% 以上，而且相差小于5%，故在180 min停止试验［9］。又因为一般普通试剂第一次出现溶出量85%以上，2 个时间点溶出量差在5%以内（即平台期） 时，取前一时间点作为取样时间点，并将该点溶出量减去15%作为溶出限度［10］，故本实验规定取样点为120 min 时华蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出量都不少于75%，作为溶出限度。

溶出度实验是评价口服固体制剂内在质量的一种重要手段［11］。不仅可为建立体内外相关性提供基础数据，而且能成为通过体外试验评价口服固体制剂质量稳定性和均一性的简便、有效、可行的方法，对评价制剂批次质量、优化处方及制备工艺、保证处方工艺等变更前后产品质量的一致性有重要作用。本实验结果显示，泛制丸、塑制丸所得产品的溶出曲线相似，表明喉症丸溶出度并未受工艺变更的影响，进行塑制工艺改进是可行的。

表2 塑制丸中华蟾酥毒基f1、 f2 测定结果Tab.2 Results of f1 and f2 determination for cinobufagin in plastic-made pills

表3 塑制丸中脂蟾毒配基f1、 f2 测定结果Tab.3 Results of f1 and f2 determination for resibufogenin in plastic-made pills