方科益，陈树兵，李 双，王永健，王春芳，曹国洲

(1.宁波海关技术中心，宁波315040; 2.宁波中盛产品检测公司，宁波315040)

随着社会的进步和工业的发展，环境问题日益严重。一些工业废水和生活污水进入江河湖海，导致水体的富营养化，使得水体中藻类大量繁殖。海水水域富营养化会形成赤潮，淡水水域富营养化会形成水华，这些现象出现后，藻类会产生大量的藻类毒素积蓄于水中。藻类毒素一般具有剧烈毒性，可通过食物链传递，进入水生动物体内，可在滤食性的软体贝壳类动物、鱼类等水产品组织内蓄积，人类一旦过量食入，将引起中毒反应[1-4]。蓝藻毒素是一种重要的藻类毒素，它包含具有肝毒性的环肽毒素，例如微囊藻毒素，还包括具有神经毒性和细胞毒性的生物碱毒素，例如柱孢藻毒素，以及脂多糖内毒素等。研究表明，肝毒性是微囊藻毒素的主要毒性，该毒素进入人体内后，专一性的与肝细胞内的蛋白磷酸酶结合，当摄入的藻类毒素浓度较低时，具有潜在的肝毒性和癌诱发活性，当摄入的藻类毒素浓度较高时，则会引起急性中毒，严重者导致肝细胞肿胀、坏死、甚至导致死亡。柱孢藻毒素具有细胞毒性、肝毒性、遗传毒性和神经毒性，且同样可能致癌[5-10]。

早期对于蓝藻毒素的检测方法主要有小鼠测试法、酶联免疫检测法等生物学方法。近年来，高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等分析方法逐渐成为蓝藻毒素的主要检测方法[11-13]。张维昊等[14]采用高效液相色谱法测定了鱼类样品中微囊藻毒素的含量;行业推荐性标准SN/T 4319－2015规定了采用液相色谱-串联质谱法测定水产品中微囊藻毒素的含量。其他种类的蓝藻毒素的检测方法报道主要集中于水基质，关于水产品基质的报道还较少。在食品残留及污染物筛查技术研究中，高分辨质谱法(HRMS)已得到一定的推广和应用，例如静电场轨道阱高分辨质谱技术(Orbitrap MS)和飞行时间质谱技术(TOF-MS)等依靠精确质量数(可精确到小数点第4 位)和保留时间对目标物进行定性识别[15]。该技术在水产品中蓝藻毒素的检测领域应用还较少。

本工作选择柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 作为分析对象，利用Qu ECh ERS技术作为前处理方法，并通过优化最佳技术参数，结合高效液相色谱-高分辨质谱法(HPLC-HRMS)测定水产品中3种蓝藻毒素的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Fisher Q-Exactive型高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪，配电喷雾离子源(ESI);Heldolph Multi Reax型旋涡混合仪;KQ-500DE 型超声波清洗仪;N-EVAP 型氮吹仪;M2002E型电子天平;Millipore型超纯水器。

柱孢毒素标准储备溶液:30μmol·L－1，介质为甲醇。

微囊藻毒素LR 标准储备溶液:20 mg·L－1，介质为甲醇。

微囊藻毒素RR 标准储备溶液:20 mg·L－1，介质为甲醇。

甲醇为高效液相色谱纯级;甲酸、甲酸铵、无水硫酸钠和中性氧化铝均为分析纯;其他试剂均为色谱纯;石墨化碳黑(GCB);试验用水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 仪器工作条件

1)Hypersile Gold C8色谱柱(150 mm×2.1 mm，3μm);流动相A 为含2 mmol甲酸铵的0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液，B为含2 mmol甲酸铵和0.1%甲酸的95%(体积分数，下同)乙腈溶液;流量为0.3 m L·min－1;进样量为10μL。梯度洗脱程序见表1。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI);正离子(ESI＋)模式下的电压为3 800 V，负离子(ESI－)模式下的电压为2 700 V;气化温度为350 ℃;鞘气为氮气，流量为35 L·h－1;辅助气为氮气，流量为10 L·h－1;离子传输管温度为300 ℃;质荷比(m/z)为100～2 000。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 试验方法

试样以鱼体、虾体和贝类为样品，鱼体样品去鳞、去皮，取肌肉组织部分;虾体样品去壳、去头，取可食用部分;贝类样品取可食用部分。经均质混匀后，于－18 ℃以下冷冻保存备用。

称取样品2.00 g于离心管中，加入约2 g无水硫酸钠，搅拌混匀，加入10 m L 甲醇，涡旋振荡5 min，超声5 min，以9 000 r·min－1的转速离心5 min，取上清液。向上清液中加入500 mg中性氧化铝和15 mg GCB，涡旋振荡1 min，以9 000 r·min－1的转速离心5 min，取上清液，于40 ℃下吹氮至近干，用体积比为1∶1的流动相A-流动相B 混合溶液溶解残渣并定容至2.0 m L，经过0.22μm 尼龙滤膜过滤，按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对3种蓝藻毒素的混合标准溶液进行测定，色谱图见图1。

图1 3种蓝藻毒素的混合标准溶液的选择离子色谱图Fig.1 Selective ion chromatograms of mixed standard solution of the 3 cyanobacterial toxins

2.2 仪器工作条件的选择

质谱条件中采用ESI＋、ESI－切换模式进行全扫描，通过提取一级质谱的精确质量数进行定性和定量，必要时可设置自动触发二级质谱进一步提高定性的准确度，超高的分辨率有助于解析复杂的样品，确保Q-Orbitrap系统能够在一次色谱运行中最大限度的检测和鉴定目标物。

通过直接进样，对3种蓝藻毒素的单标准储备溶液分别进行ESI＋、ESI－模式全扫描，结合其结构式及理论质量数，确定各蓝藻毒素的最佳电离模式及相应母离子的质量数。

结果发现:柱孢藻毒素在ESI－模式下的响应值明显高于ESI＋模式下的响应值;微囊藻毒素LR 在ESI＋模式下的响应值更高;微囊藻毒素RR 在ESI＋模式下的响应并不强烈，但其在双电荷电离模式下响应值较强，形成[M ＋2 H]2＋峰，试验将519.790 0作为其母离子。3 种蓝藻毒素的质谱图见图2。

图2 3种蓝藻毒素的质谱图Fig.2 Mass spectra of the 3 cyanobacterial toxins

2.3 提取条件的选择

柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR均为亲水性物质，易溶于水，也易溶于甲醇等极性有机溶剂。甲醇等有机溶剂可使水产品中的蛋白杂质变性，起到沉淀蛋白的作用。行业推荐性标准SN/T 4319－2015中采用10 m L 甲醇对2 g水产品中的微囊藻毒素进行提取，提取率较好。此外，提取液体系中若有水存在，不利于后续的净化及浓缩过程，试验采用加入2 g无水硫酸钠的方法来吸收提取液体系中的水分。因此，试验选择的提取体系由提取溶剂10 m L甲醇和吸水剂2 g无水硫酸钠组成。

2.4 净化条件的选择

MATTAROZZI等[16]采用HRMS对水产品中的亲水性贝类毒素进行测定。结果发现，在提取液未经过净化或者净化不充分情况下，基质效应导致目标物信号降低或缺失，可见基质效应对生物毒素类物质在高分辨质谱仪上的离子化及仪器响应上具有较大的影响。QuECh ERS 提取过程中常用的净化载体主要有十八烷基键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、GCB、中性氧化铝和无水硫酸镁等，试验考察了上述5种净化载体对3种蓝藻毒素回收率的影响，结果见图3。

图3 5种不同的净化载体对3种蓝藻毒素回收率的影响Fig.3 Effects of 5 different purification carriers on the recovery of the 3 cyanobacteria toxins

由图3可知:净化载体PSA 对微囊藻毒素LR和微囊藻毒素RR 的回收率均低于65%;净化载体无水硫酸镁对微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的回收率均在70%以上;净化载体C18和中性氧化铝对微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的回收率均在88%以上。由于净化载体PSA 对3种蓝藻毒素的回收率较低，试验选择净化载体C18、GCB、中性氧化铝和无水硫酸镁对样品进行净化处理。

试验还观察了50 mg C18、15 mg GCB、500 mg中性氧化铝和500 mg无水硫酸镁作为净化载体时对3种蓝藻毒素基质溶液净化效果的影响。结果发现:净化载体C18对油脂的吸附效果不明显;净化载体GCB能将基质中的天然色素去除，净化后的溶液基本无色素杂质;净化载体中性氧化铝能有效降低基质溶液中的油脂含量，是4种净化载体中对油脂吸附能力最明显的;净化载体无水硫酸镁虽然对油脂等杂质具有一定的吸附能力，杂质含量有所减少，但其净化效果不突出。综合考虑，试验选择的净化载体由500 mg中性氧化铝和15 mg GCB组成。

2.5 基质效应

试验采用空白样品基质配制混合工作溶液系列，用溶剂配制混合标准溶液系列，以工作曲线的斜率与标准曲线的斜率之比k来评价基质效应，当k小于1时为基质减弱效应;当k等于1时无基质效应;当k大于1时为基质增强效应。结果发现:柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的k分别为0.582，0.721，0.773，说明3种蓝藻毒素的基质效应均为基质减弱效应，试验需要采用基质标准溶液系列对3种蓝藻毒素进行定量分析。

2.6 工作曲线、检出限和测定下限

用空白基质溶液将3种蓝藻毒素的混合标准溶液稀释为10，20，50，100，200μg·L－1的混合工作溶液系列，按照试验方法对其进行测定。以3种蓝藻毒素的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。3种蓝藻毒素的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收试验

试验以空白鲫鱼和黄鱼样品作为基质，对其添加10，20，50μg·kg－1的混合标准溶液，按照仪器工作条件对每个加标样品平行测定6次，计算3种蓝藻毒素的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3 可知:3 种蓝藻毒素的回收率为68.3%～104%，测定值的RSD 为7.7%～17%。

2.8 实际样品的测定

按照试探方法对从市场采购的2个鲫鱼样品、2个螺蛳样品、2个黄鱼样品和2个蛏子样品进行测定。结果发现:1个螺蛳样品中检出了微囊藻毒素RR，质量分数为17.3μg·kg－1;其余样品中均未检出蓝藻毒素。

本工作基于Qu ECh ERS 前处理技术，建立了水产品中柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 及微囊藻毒素RR 等3种蓝藻毒素的HPLC-HRMS分析方法。该方法操作简便可行，灵敏度良好，可满足日常分析要求。同时，在将来的研究过程中，也可为推广并应用于其他藻类毒素的检测提供参考。