龚本华 李先文 唐兴贵 罗占云 李江 胡锦 贺化祥 黄莺 高焕晔

摘要：為了防止植烟土壤养分流失，探索烟草农业的可持续发展。本试验设置稻草草苫覆盖、稻草草段覆盖、地膜覆盖、露地栽培共4个处理，采用随机区组设计，研究了秸秆覆盖对植烟土壤酸碱度及养分状况的影响。研究结果表明：机编稻草草苫覆盖可以使pH值偏低的酸性土壤，逐步改良至适宜植烟的微酸性土壤，且保持大田生育期内的土壤pH值相对稳定。秸秆覆盖能极显著地提高植烟季大田中后期的土壤有机质的含量。机编草苫覆盖能提高土壤耕作层中的全氮和碱解氮的含量，机编草苫覆盖对土壤全氮的增加较为显著，尤其在移栽后90 d增加最多，但到了移栽后120 d，则以草段覆盖最高。覆盖栽培条件下的土壤有效磷的含量总体低于露地栽培处理。稻草秸秆覆盖能提高大田中后期土壤中速效钾含量。总体来看，稻草草苫覆盖和草段覆盖可以作为烟区替代常规地膜覆盖的优先选项之一。本研究结果为烟区植烟土壤保育技术提供了参考。

关键词：秸秆覆盖方式;植烟土壤;酸碱度;养分状况

中图分类号：S1582;S572

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）06-0028-09国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.005

Effects of Straw Mulching on pH and Nutrient Status of Tobacco Growing Soil

GONG Ben-hua1，LI Xian-wen2，TANG Xing-gui2，LUO Zhan-yun2，LI Jiang2，HU Jin1，HE Hua-xiang1，HUANG Ying1，GAO Huan-ye1*

（1College of Tobacco Science of Guizhou University，Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality，Guiyang，Guizhou 550025，China;2Tobacco companies of Guizhou province Qiannan Corporation，Duyun，Guizhou 558000，China）

Abstract：Due to years of cultivation and long-term application of inorganic chemical fertilizers， some tobacco fields gradually lose their nutrient balance. In order to improve the soil nutrients of tobacco planting and explore the sustainable development of tobacco agriculture， a randomized block design was used in this experimen with a total of four treatments： straw mulching， straw segment mulching， plastic film mulching and open-land cultivation treatment. The effects of straw mulching on soil pH and nutrient status were studied. The results showed that  acidic soil with low pH value treated by straw mulching can be gradually improved to slightly acidic soil， which was suitable for tobacco planting， and keep relatively stable pH value in the soil during the growing period. Straw mulching can significantly increase the content of soil organic matter in the middle and later stages of tobacco growing period. Machine-woven straw mulching not only can increase the content of total nitrogen and alkali-hydrolyzed nitrogen in soil tillage layer， but also can significantly increase the content of total nitrogen in soil， especially in 90 days after transplanting. while， that treated with straw mulching is the highest in 120 days after transplanting. The content of available phosphorus in soils under mulch cultivation was lower than that under open-land cultivation. Straw mulch can improve the content of available potassium in soils in the middle and late stages of tobacco growing period. Overall， straw mulching and straw segment mulching can be used as one of the preferred alternatives to conventional plastic film mulching in tobacco growing areas in southern Guizhou， and the results of this study provide a reference for soil conservation technology of tobacco planting in this area.

Keywords：Sogatella furcifera; ABC transporter; sublethal; insecticide; expression analysis

白背飞虱Sogatella furcifera （Horváth）为典型的r￣对策昆虫，是一种危害严重的远距离迁飞性水稻害蟲[1]。它以成虫、若虫直接刺吸稻株韧皮部或在叶鞘内产卵，破坏水稻韧皮部，影响植物光合速率，从而使水稻生长迟缓，瘪粒增加;为害严重时则造成稻株枯死，呈现“虱烧”状态[2];同时，白背飞虱还是南方水稻黑条矮缩病（southern rice black￣streaked dwarf virus，SRBSDV）的主要传播媒介[2]，给水稻生产造成严重经济损失。长期以来，化学防治一直都是防治白背飞虱的主要手段[3]，但是容易产生一些负面影响[4]。据报道，白背飞虱已对多种杀虫剂产生明显抗药性，导致害虫再猖獗[5]，这与近年来白背飞虱的暴发频率大大增加有着密切的关系。

ABC转运蛋白（ATP￣binding cassette transporter，

ABC transporter）广泛分布于各种生物体中，能对生物体内各种生物分子进行跨膜转运[6]。有学者对ABC转运蛋白进行了系统的研究，表明ABC转运子在分子转运过程中，以及杀虫剂抗性、代谢和昆虫的发育过程中都起着重要的作用[7]。越来越多的研究表明，昆虫体内的ABC转运蛋白直接参与杀虫剂的抗性，例如，ABCB、ABCC和ABCG等是最为常见的参与杀虫剂转运与抗性形成的ABC转运蛋白亚家族基因[8]。在桃蚜Myzus persicae 的抗蚜威（pirimicarb）抗性品系中，ABCG 和ABCH亚家族基因表达水平显著高于敏感品系[9];小菜蛾Plutella xylostella ABCA、ABCC、ABCG、ABCH和ABCF亚家族的ABC转运蛋白在毒死蜱抗性菌株中过表达[10];灰飞虱Laodelphax striatellus ABCB、ABCC、ABCD和ABCG亚家族中的8个ABC转运蛋白可能参与了灰飞虱对一些杀虫剂的抗性[11]。对白背飞虱的研究中也发现，ABCG亚家族基因参与了白背飞虱对杀虫剂胁迫的适应[12，13]。更多研究表明，ABC转运蛋白的表达与昆虫抗性的产生关系密切。然而，白背飞虱中关于ABCG亚家族的转运蛋白之外的基因还未见报道。

本研究通过RT￣PCR技术克隆了白背飞虱的ABCB2转运蛋白基因，并通过qPCR技术测定了防治白背飞虱的常用药剂噻虫嗪、噻嗪酮和阿维菌素LC10、LC25、LC50和LC90胁迫48 h后ABCB2基因的相对表达量，旨在了解ABCB2基因在白背飞虱响应杀虫剂胁迫中的作用，为研究白背飞虱对杀虫剂的适应及抗药性产生的分子机制打下基础。

1材料与方法

11供试昆虫

白背飞虱于2013年采自贵阳市花溪区水稻田，在室内不接触任何农药饲养至今。饲养条件为：温度（25±1） ℃，相对湿度70%±10%，光照L∶D=16∶8。以3龄若虫为供试昆虫。

12供试试剂

试剂名称及其生产厂家如表1所示。

13虫源准备

基于本实验室前期对白背飞虱毒力测定结果[14]，随机挑选300头3龄若虫，采用稻茎浸渍法[15]，用噻虫嗪、噻嗪酮和阿维菌素的4个浓度（LC10、LC25、LC50、LC90）分别进行胁迫处理。将处理后的白背飞虱置于人工气候箱内饲养48 h后取样，每个样品取15头存活若虫，每个处理重复3次，放置在￣80 ℃冰箱中保存备用。

14总RNA提取及cDNA合成

将上述所取样品置于研钵中用液氮充分研磨后，通过Trizol试剂提取白背飞虱总RNA，具体按照Trizol试剂说明书进行操作[16]。利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量，最后按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书合成cDNA第一链[16]，以此作为PCR扩增模板。

15白背飞虱ABCB2基因的克隆

通过本实验室前期实验转录组结果中找到白背飞虱ABCB2基因的部分片段[17]，再以此片段为模板在白背飞虱全基因组数据中进行搜索[18]，找到相对应的基因，并通过NCBI 进行Blast比对，初步确定该基因为ABCB2基因。利用Primer Premier 60软件设计基因特异性引物（表2），进行PCR扩增验证。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1～3 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经电泳检测合格后，将扩增产物纯化后连接到载体上做克隆，将克隆后的产物继续扩大培养送往测序公司进行测序，测序结果利用Blastx 进行相似性比对。

16白背飞虱ABCB2基因序列分析

基于已获得的白背飞虱ABCB2基因的cDNA全长序列，利用NCBI（http：//wwwncbinih gov/ BLAST/）的BLAST程序进行核苷酸和氨基酸序列的相似性搜索比对;利用DNAMAN软件（version 60、Lynnon Biosoft、Quebec、Canada）分析推断得氨基酸序列;利用ORF Finder软件（http：//wwwncbinlmnih

gov/gorf/gorfhtml）鉴定白背飞虱ABCB2基因的ORF;利用SWISS￣PROT（ExPASy server）工具的“Compute pI / Mw”（http：//auexpasyorg/tools/pi_toolhtml）计算ABCB2的分子量和理论等电点;使用PFAM软件（http：//pfamxfamorg/）预测ABCB2的保守结构域;采用MEGA 70 软件[19]中的邻接法（neighbor￣joining，NJ） 构建系统发育树，重复运行1 000次。

17杀虫剂胁迫下白背飞虱ABCB2基因的表达分析

根据白背飞虱ABCB2基因cDNA全长序列设计荧光定量引物，从白背飞虱RPL9基因（Genebank：KM885285）作为内参基因[20]，以反转录获得的cDNA为模板，依据表2中所设计的引物进行荧光定量 PCR。检测不同种杀虫剂和不同浓度杀虫剂胁迫后的白背飞虱ABCB2基因的表达量，每个样品设3次生物学重复和3次技术重复。反应体系和条件参照 2 x iIaqTM SYBR Green supermix试剂盒说明书，具体反应体系和条件如下（见表3）：

反应条件：

95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s，50 ℃退火并延伸30 s，40个循环;接着 60～95 ℃ 的溶解曲线。

18数据分析

荧光定量所得表达数据用SPSS 170 统计学软件进行分析处理，采用单因素方差分析（One￣way ANOVA）和LSD多重比较，并利用2-△△CT法来计算白背飞虱ABCB2基因在不同杀虫剂及不同浓度处理后的相对表达量，最后采用Sigma Plot 125软件进行图形绘制。

2结果与分析

21白背飞虱ABCB2基因克隆和序列分析

以白背飞虱的转录组数据和基因组数据为基础，得到1个ABCB亚家族基因;并采用RT￣PCR技术对其进行验证，得到长度为2 412 bp的基因片段;通过NCBI比对，得到了白背飞虱ABC转运蛋白亚家族基因，命名为ABCB2（MN475970）。分析显示，ABCB2 cDNA全长序列包含完整的2 265 bp，编码754个氨基酸的开放阅读框（ORF）（图1）。其分子量约为83855 kDa，预测理论等电点为929。

22白背飞虱ABCB2系统发育及结构域分析

使用PFAM软件对ABCB2的保守结构域结构进行序列分析，结果表明：白背飞虱ABCB2转运蛋白包含有1个核苷酸结合域（Nucleotide binding domain，NBD）和1个跨膜结构域（Transmembrane domain，TMD），属于半分子转运蛋白（图2）。为分析获得的白背飞虱ABCB2转运蛋白与其他物种ABCB亚家族转运蛋白家族成员的进化关系，将白背飞虱ABCB2转运蛋白与所选取物种的ABCB亚家族转运蛋白的氨基酸序采用NJ法构建系统发育树。结果表明：在发育树中，ABCB2与褐飞虱、灰飞虱两种飞虱距离较近，尤其以灰飞虱的距离最近，说明白背飞虱与灰飞虱和褐飞虱具有较近的亲缘关系，而与其他昆虫的ABCB亚族成员亲缘关系相对较远。

23杀虫剂胁迫下白背飞虱ABCB2基因表达分析

通过噻虫嗪、噻嗪酮和阿维菌素的4个浓度（LC10、LC25、LC50、LC90）分别处理白背飞虱3龄若虫48 h后，测定在杀虫剂胁迫下白背飞虱ABCB2基因的相对表达量。在白背飞虱ABCB2基因表达量分析中发现（图3）：与对照组（CK）相比，噻虫嗪LC10浓度胁迫后的ABCB2基因表达量被显著诱导（P<005），但LC25、LC50 和LC90 处理组与对照组相比，ABCB2基因表达量并无显著性变化（P>005），且随着噻虫嗪浓度升高，白背飞虱ABCB2基因的表达量呈现下降趋势。在噻嗪酮LC25处理下的ABCB2基因相对表达量显著低于对照组，而在噻嗪酮LC10浓度处理下显著诱导表达（P<005），但LC50 和LC90 处理组与对照组相比差异不显著。与之相反的是，阿维菌素胁迫白背飞虱3龄若虫48 h后，ABCB2基因的表达量仅在LC90浓度处理下显著诱导，而在LC10和LC25浓度处理下ABCB2基因相对表达量均显著低于对照组（P<005），且随着浓度升高其表达量呈现上升趋势。

3结论与讨论

ABC转运蛋白是一类重要的跨膜转运蛋白，在生物体内以全分子或半分子转运蛋白形式存在。全分子转运蛋白包含2个NBD和2个TMD，半分子转运蛋白包括1个NBD和1個TMD[21]。在本研究中，我们依托白背飞虱的转录组和全基因组数据，结合RT￣PCR法，成功获得了一个ABCB亚家族转运蛋白，命名为ABCB2。ABCB2转运蛋白包含有1个NBD和1个TMD，属于半分子转运蛋白。这一结果，与对灰飞虱的研究结果一致[11]。另外，我们对其他昆虫的相似基因进行了结构域分析，发现该基因均含有1个NBD和1个TMD，属于半分子转运蛋白（图2），表明该基因在昆虫中是高度保守的。

害虫抗性的产生机制主要归因于酶活性的增强，因为酶活性的增强可以快速代谢部分杀虫剂物质[22]，而解毒过程可分为3个阶段同，即Ⅰ期、Ⅱ期代谢酶解毒过程和Ⅲ期转运体体外转运[23]。参与Ⅰ期和Ⅱ期解毒过程的主要酶有：P450单加氧酶、谷胱甘肽S￣转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarEs）等[23]，而ABC转运蛋白则是Ⅲ期转运体的主要组成部分[24]。越来越多的研究表明，ABC转运蛋白的表达与昆虫抗性的产生关系密切。白背飞虱在高剂量（LC85）的环氧虫啶处理下，一个ABCG基因和一个ABCC基因的表达被上调，并且在低剂量（LC15）的环氧虫啶处理下两个ABCG基因被上调[12];阿拉伯按蚊Anopheles arabiensis DDT 抗性品系中，ABCG亚家族基因表达量均增加[25]。另有研究表明，ABCB6和多药耐药蛋白ABCG2是细胞内卟啉类化合物平衡调节的两个主要成员[26]。在本研究中发现，噻嗪酮和噻嗪酮LC10浓度处理能够显著诱导白背飞虱ABCB2基因的表达水平;另外，阿维菌素胁迫后，ABCB2基因的表达量在LC90浓度处理下被显著诱导。这些结果表明：白背飞虱ABCB2基因能够响应杀虫剂的胁迫，但对不同杀虫剂及其同一种杀虫剂的不同浓度，其作用不同。本研究结果，可为进一步了解ABCB2基因在白背飞虱抗药性的产生及其对杀虫剂胁迫的适应性中的作用打下基础。

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