顾仁勇 陈晓娟

(吉首大学化学化工学院，吉首 416000)

牡丹籽为毛茛科芍药属灌木牡丹的种子，含油量高达30%，并且富含不饱和脂肪酸[1]，是近年来大力发展的新木本油料资源。牡丹籽油于2011年被我国卫生部批准为新资源食品，进一步促进了牡丹籽油产业的快速发展。牡丹籽粕是牡丹籽制油后的主要副产物，含有多种营养成分及多糖、黄酮类化合物、单萜苷类、多酚等功能活性物质[2,3]，因而具有重要的开发利用价值。

植物多酚类物质因具有良好的抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、清除体内自由基等生理和药理活性[4-6]，成为研究热点。多酚类物质提取主要有溶剂提取、金属离子沉淀、树脂分离法和超临界萃取等方法[7-10]。目前牡丹籽粕多酚的提取仅有溶剂提取的报道[11]，单纯的溶剂浸提提取率较低，通常需要微波或超声波辅助以提高提取效率。超临界CO2萃取技术具有工艺简单、萃取高效、产品性质稳定等优点，在植物多酚的提取中得到了广泛应用，但用于牡丹籽粕多酚提取及其抗氧化性研究鲜有报道。另外，由于多酚类物质分子极性强，在CO2流体中的溶解度相对较低，添加乙醇等极性夹带剂能有效提高对酚类的溶解能力，从而提高萃取效果。

本研究采用超临界CO2萃取技术提取牡丹籽粕多酚，重点探讨了夹带剂、萃取温度和萃取压力对提取效果的影响，优化了工艺参数，并测定了其体外抗氧化能力，可为牡丹籽粕多酚综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

牡丹籽粕：湖南优镒农业开发有限公司。

福林-酚试剂(BR，1.0 mol/L)；没食子酸标准品；DPPH；ABTS；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外-可见分光光度计；HA121-50-01超临界CO2萃取装置；F1-130药物粉碎机；YZF-6250L真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取牡丹籽粕多酚

牡丹籽粕真空干燥至含水量10%左右，粉碎，控制粉末粒度为80目[12]。称粉料200 g，装入萃取罐，按原料：夹带剂(g/mL)=1∶1.2的量加入乙醇夹带剂240 mL，浸润30 min[13]，超临界萃取2.5 h，收集萃取产物。按公式计算多酚提取量：

1.3.2 多酚含量测定1.3.2.1 标准曲线绘制[14]

配制质量浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/100 mL的没食子酸标准品溶液，各取1.0 mL分别加入6支比色管中，依次加入0.5 mol/L的福林-酚试剂4.0 mL，再依次加入质量分数12.0%的Na2CO3溶液5.0 mL，静置2 h，于765 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线，得吸光度(A)与没食子酸质量浓度(C)与的线性方程：A=1.004 3C-0.058(R2=0.997 5)，用于样品中多酚含量测定。

1.3.2.2 产品多酚含量测定

取提取物样品1.0 mL，加蒸馏水稀释使其质量浓度处于标准曲线的有效浓度范围，吸取1.0 mL稀释液，加入比色管，如标准曲线测定方法处理，于765 nm波长处测吸光度，重复3次，带入回归方程计算多酚含量。

1.3.3 萃取条件优化实验

选取乙醇(夹带剂)体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、萃取温度(40、45、50、55、60 ℃)和萃取压力(20、25、30、35、40 MPa)3个因素的变量水平，进行单因素实验，以多酚提取率为响应值，初步优选萃取条件。在单因素实验结果的基础上，采用Box-Behnken响应面实验设计对乙醇(夹带剂)体积分数、萃取温度和萃取压力3个条件组合进行优选。实验因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.3.4 抗氧化实验1.3.4.1 DPPH·清除能力

参考文献[15]方法略改动，配制不同质量浓度牡丹籽粕多酚溶液，各取2.0 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液2.0 mL，充分混合，室温下避光反应30 min，517 nm波长处测吸光度A1。按此法以等体积无水乙醇代替多酚溶液，测吸光度A2；以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，测吸光度A3。以VC为参照，每组重复3次。计算DPPH·清除率。

1.3.4.2 ABTS+·清除能力

参考文献[16]方法略改动，将7 mmol/mL的ABTS原液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，常温避光反应12～16 h，使用前用无水乙醇稀释，使ABTS溶液在734nm处吸光值为(0.7±0.02)。取牡丹籽粕多酚提取液0.2 mL与2.4 mL ABTS溶液充分混匀，避光反应6 min，在734 nm处测吸光度A1，以无水乙醇代替多酚提取液测吸光度A。以VC为参照，每组重复3次。计算ABTS+·清除率。

1.3.5 数据处理

采用Minitab16进行数据的方差分析及显著性检验，采用Design-Expert 8.05进行Box-Behnken实验设计及数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇(夹带剂)体积分数对多酚提取量的影响

萃取温度50 ℃、萃取压力30 MPa，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%时牡丹籽粕多酚提取量见图1。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，余同。图1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

由图1可见，乙醇体积分数由50%逐步增加至80%时，多酚提取量由10.72 mg/g逐步提高至18.44 mg/g，提升效果显著(P<0.05)，并达到最大值。酚类分子极性大，加入乙醇等极性夹带剂能提升CO2流体对酚类的溶解能力，利于萃取[17,18]。乙醇体积分数大于80%，提取量反而有所降低，这可能是体积分数过大的夹带剂也会使超临界流体密度降低，而影响酚类的提取。因此，乙醇体积分数最佳为80%。

2.1.2 萃取温度对多酚提取量的影响

图2 萃取温度对多酚提取量的影响

乙醇体积分数80%、萃取压力30 MPa，萃取温度分别为40、45、50、55、60 ℃时牡丹籽粕多酚提取量见图2。萃取温度由40 ℃逐步增大至50 ℃时，多酚提取量由12.86 mg/g逐步提高至18.43 mg/g，提升效果显著(P<0.05)，并达到最大值；温度继续由50 ℃增至60 ℃，提取量反而显著降低(P<0.05)。温度升高一方面可增大被萃取物质的扩散系数而提高提取量，同时也会降低CO2和夹带剂密度，使被萃取物质溶解度降低而降低萃取效果[17,18]。因此，选择萃取温度为50 ℃。

2.1.3 萃取压力对多酚提取量的影响

乙醇体积分数80%、萃取温度50 ℃，萃取压力分别为20、25、30、35、40 MPa时牡丹籽粕多酚提取量见图3。萃取压力由20 MPa逐步增大至30 MPa时，多酚提取量由13.23 mg/g逐步提高至18.47 mg/g，提升效果显著(P<0.05)，并达到最大值；压力继续增大时，提取量反而显著降低(P<0.05)。萃取压力升高，CO2流体密度增大，增加多酚类物质的溶解及缩短分子间的传质距离，利于萃取；但压力过高，溶质的扩散系数减小，传质阻力增大，导致提取量降低[17,18]。因此，最优萃取压力为30 MPa。

图3 萃取压力对多酚提取量的影响

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 实验方案及结果

依据单因素实验结果，采用Box-Behnken响应面法，以多酚提取量为响应值，优化乙醇(夹带剂)体积分数、萃取温度和萃取压力3个条件。实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 方差分析

对表2中的数据进行多元回归拟合，得牡丹籽粕多酚提取量(Y)与各因素回归方程：

Y=18.22+0.53A+0.88B+0.74C+0.16AB-0.46AC-0.71BC-0.62A2-0.93B2-0.42C2

表3 回归方程的方差分析

图4各因素交互作用的响应面

据方差分析结果可判断，因素A(乙醇体积分数)、B(萃取温度)、C(萃取压力)对提取量均有极显著影响(P<0.01)；二次项A2、B2存在极显著影响(P<0.01)，C2存在显著影响(P<0.05)，表明各因素对提取量存在显著的曲线效应；因素交互项AC、BC对提取量影响极显著(P<0.01)，AB影响不显著(P>0.05)，表明因素AC、BC间存在极显著的交互效应，AB间无交互效应；由F值可判断，因素影响主次顺序为：萃取温度>萃取压力>乙醇(夹带剂)体积分数。

2.2.3 响应面分析

3个因素间交互作用响应面及等高线图见图4。响应面图中某因素图形变化坡度大，等高线密集，则表明该因素对响应值影响大；等高线接近椭圆表明两因素交互影响大，接近圆形表示交互效应小[19]。

由图4a可见，响应面图中沿萃取压力方向图形坡度更为陡峭，等高线变化更加密集，表明萃取压力的影响大于乙醇体积分数，对多酚提取量贡献更大；等高线接近椭圆，表明乙醇体积分数和萃取压力间交互效应明显。同理，图4b中萃取温度的影响大于萃取压力，对多酚提取量的贡献更大，萃取温度与萃取压力间交互效应明显；图4c中，萃取温度对提取量的影响和贡献大于乙醇体积分数，等高线近圆形，表示两因素交互效应不明显。

2.2.4 最优萃取条件的预测及验证

利用回归方程预测牡丹籽粕多酚最优萃取条件为：乙醇体积分数83.34%、萃取温度51.76 ℃、萃取压力31.97 MPa，预测多酚提取量为18.61 mg/g。为了便于实际操作，将提取条件调整为：乙醇体积分数83%、萃取温度52 ℃、萃取压力32 MPa，以此条件进行验证实验，重复3次，提取量平均值18.58 mg/g，与预测值接近，表明回归方程可靠，所得最优萃取条件可用于牡丹籽粕多酚的提取。

2.3 抗氧化实验结果

2.3.1 DPPH·清除实验结果

配制质量浓度30、60、90、120、150 μg/mL的牡丹籽粕多酚及VC溶液，测定其对DPPH·清除率，结果见图5。在质量浓度30～150 μg/mL范围内，牡丹籽粕多酚对DPPH·具有良好的清除能力，且随着质量浓度的增大，清除率由13.3%显著增强至56.1%(P<0.05)。质量浓度30～60 μg/mL间，同质量浓度下牡丹籽粕多酚与VC对DPPH·的清除率无显著差异(P>0.05)；质量浓度大于90 μg/mL时，同质量浓度下牡丹籽粕多酚对DPPH·的清除率显著强于VC(P<0.05)，且两者清除率的差异随质量浓度增大而增大。

分析表明牡丹籽粕多酚和VC质量浓度与DPPH·的清除率间均存在极显著的直线正相关(P<0.01，R2分别为0.982 6、0.986 2)，表明两者抗氧化活性均存在明显的量效关系。利用回归方程计算抑制率为50%时牡丹籽粕多酚和VC的质量浓度IC50分别为128.22 μg/mL和147.72 μg/mL，也表明牡丹籽粕多酚对DPPH·的清除能力显著强于VC(P<0.05)。

图5 牡丹籽粕多酚对DPPH·的清除率

2.3.2 ABTS+·清除实验结果

配制质量浓度30、60、90、120、150 μg/mL的牡丹籽粕多酚及VC溶液，测定其对ABTS+·清除率，结果见图6。在质量浓度30～150 μg/mL范围内，牡丹籽粕多酚对ABTS+·表现出良好的清除能力，且随质量浓度的增大清除率由25.1%显著增强至64.2%(P<0.05)。同质量浓度下牡丹籽粕多酚对ABTS+·的清除率显著强于VC(P<0.05)，且两者清除率的差值随质量浓度增大而增大。

图6 牡丹籽粕多酚对ABTS+·的清除率

分析表明牡丹籽粕多酚和VC质量浓度与ABTS+·清除率间均存在极显著的直线正相关(P<0.01，R2分别为0.996 0、0.993 6)，表明两者抗氧化活性存在明显的量效关系。利用回归方程计算牡丹籽粕多酚和VC对ABTS+·的IC50分别为109.18 μg/mL和142.66 μg/mL，也表明牡丹籽粕多酚对对ABTS+·的清除能力显著强于VC(P<0.05)。

3 结论

超临界萃取牡丹籽粕多酚最优条件为：乙醇体积分数83%、萃取温度52 ℃、萃取压力32 MPa，此条件下提取量为18.58 mg/g。在超临界CO2萃取牡丹籽粕多酚工艺条件中，萃取温度与萃取压力、乙醇(夹带剂)体积分数与萃取压力之间存在协同效应，合理优化参数有利于提高牡丹籽粕多酚的提取量及产品的稳定性。牡丹籽粕多酚对DPPH·和ABTS+·的清除能力均显著强于VC。超临界CO2萃取技术适用于牡丹籽粕多酚的提取，牡丹籽粕多酚可作为天然抗氧化活性剂和自由基清除剂开发利用。