王金良，于新友，陈金龙，沈志强，

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院 256600；2.山东绿都生物科技有限公司 256600）

非洲猪瘟于1921 年首次发生于非洲肯尼亚， 是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种烈性传染病，其主要临床症状表现为高热、急性和高死亡率，剖检主要变化为脾增大、淋巴组织坏死和出血、凝血不良等；在1957 年以前，该病一直在非洲中部和南部国家流行， 之后传入欧洲的葡萄牙等国家，1970 年开始呈世界多地区流行， 包括意大利、 西班牙、巴西、 古巴等国家， 给世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。2018 年非洲猪瘟呈现全球大爆发、大流行态势，新增疫情国家数同比上升30%，同年8 月ASF 传入我国，截止2019 年7 月共发生疫情143 起，扑杀生猪116 万头，给我国的养猪业带来沉重打击。

目前，ASF 尚无有效疫苗用于预防，防控主要依靠严格的生物安全措施， 辅以准确、 快速的病原检测技术。 ASFV 为双链DNA 病毒，也是虫媒DNA 病毒，病毒直径约200nm，正六边形，依据病毒主要衣壳蛋白p72 基因序列，ASFV 可分为24 个不同基因型，同时p72 蛋白也是ASF 血清学检测的主要应用抗原。为了更好防控非洲猪瘟的发生， 国内外学者开展了非洲抗原抗体快速检测技术的研究，包括免疫荧光、ELISA、免疫层析试纸条、PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增等方法[1-3]。 本文选取了商品化的基于荧光定量PCR、 环介导等温扩增技术的试剂盒进行了初步比较，旨在为产品的选择使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

3 种商品化ASFV 核酸检测试剂盒，ASFV 荧光PCR 检测试剂盒 （试剂盒反应液为液体制剂） 为A 厂家产品、ASFV 荧光PCR 检测试剂盒（反应液为冻干制剂）为B 厂家产品、非洲猪瘟病毒可视化DNA 检测试剂盒（反应液为液体制剂）为C 厂家产品，检测样品为非洲猪瘟病毒B646L 基因质粒标准物质（标准物质编号GBW(E) 091034）；所用仪器为英国MyGo pro 荧光PCR仪。

1.2 试验方法

将非洲猪瘟病毒B646L 基因质粒标准物质进行10 倍比稀释（1 号样品为6×102拷贝/μL、2 号样品为6×101拷贝/μL、3 号样品为6×100拷贝/μL、4 号样品为6×10-1拷贝/μL、5 号样品为6×10-2拷贝/μL、6 号样品为6×10-3拷贝/μL、7 号样品为6×10-4拷贝/μL），确定可检出限并计算PCR 加样体系中基因拷贝浓度；通过重复检测3 次最低拷贝数的样品，确定3 种商品化ASFV 核酸检测试剂盒的批内重复性。

ASFV 荧光定量PCR 检测试剂盒的加样体系和反应程序：加样体系均为20μL （反应液10μL、 引物混合物7.5μL、 模板2.5μL）；反应程序：95℃、30 sec，95℃、5 sec，60℃、20 sec，35 个循环。

ASFV 可视化DNA 检测试剂盒的加样体系和反应程序：加样体系 （恒温扩增反应液18μL、Bst DNA 聚合酶1μL、 模板1μL）；反应程序：64℃反应50min。

2 结果与分析

2.1 三种试剂盒敏感性比较

从图1 中可知，3 种试剂盒均具有较高的敏感性，试剂盒A敏感性最高，试剂盒B 敏感性次之，试剂盒C 的敏感性为最低，反应终体系模板拷贝数分别为0.75 拷贝/μL、7.5 拷贝/μL 和30拷贝/μL；试剂盒C 为目测法进行结果判定，而试剂盒A 和B 均借助仪器进行结果判读， 判定方式的差异是试剂盒C 敏感性低的原因之一。

图1 三种试剂盒敏感性比较

表1 3 种试剂盒批内检测稳定性比较

2.2 三种试剂盒重复性比较

选取三种试剂盒的同一批次的3 个试剂盒， 分别进行试剂盒最低检出量的样品的检测（试剂盒A 检测3 号样品、试剂盒B检测2 号样品、试剂盒C 检测1 号样品），结果表明这三种试剂盒重复试验的结果均较好， 其中试剂盒A 和B 的批内变异系数均小于1%，试剂盒C 均可通过肉眼进行阳性结果的判定。

3 讨论

非洲猪瘟对养猪业的危害巨大，一旦发病，死亡率极高，严重影响世界各国的社会经济发展。 我国自非洲猪瘟暴发以来，各级政府高度重视疫情的防控工作， 希望在疫情发生的初期加以控制，最终推动非洲猪瘟的根除计划。 目前，还没有非常有效的非洲猪瘟疫苗，严格的生物安全防控，并结合快速、敏感的病毒检测技术是控制非洲猪瘟发生、流行的主要方式[4,5]。

依据本文比较研究结果，3 种商品化的试剂盒均有很好的可重复性，可用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。 三种试剂盒的设计各有不同，也导致了试剂盒的敏感性的略有差异，如果检测样品来源于具有临床症状的猪， 由于被检测样本含有较高的病毒含量，3 种试剂盒检测结果不会有差异，若是无临床症状的猪，或病毒含量低的检测样品， 可视化的试剂盒C 则有可能出现假阴性的结果；目前，基于冻干技术的非洲猪瘟检测试剂类的产品（如试剂盒B），生产工艺上得到很大的改进，由于预分装并冻干，这在一定程度上减少了检测用时，降低了运输、储藏条件，冻干过程对检测用酶制剂有如何影响还未见有相关研究报道； 可视化DNA 检测试剂盒因其对实验室条件、 检测人员技术水平要求相对不高，可以对临床样本进行快速诊断，得到越来越多的应用，如能结合仪器进行结果判断，不但可以降低人为因素的误判，也在一定程度上会提高检测试剂盒的敏感性。 因此，随着非洲猪瘟防控的不断深入，将会有更多的新技术、新方法应用于非瘟病毒核酸的检测，哪种产品或方法更为适合，最终要依据检测的目标样品。