彭桂新，杨永锋，胡静宜，王宝林，刘向真，刘茂林，牛洋洋，方蒋平，姚旭博，陈红丽*

1. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街8 号 450000

2. 河南农业大学烟草学院，郑州市金水区农业路63 号 450002

3. 江苏中烟工业有限责任公司技术中心，南京市建邺区兴隆大街29 号 210000

烟草是重要的经济作物，对生态环境条件的变化极为敏感［1-2］。生态因素、栽培因素和遗传因素共同决定了烟叶质量的形成。其中，生态因素决定了烟叶的香型风格特征［3］。由于中国烟叶种植区域生态环境的差异，我国烟叶形成了不同的香型风格［4］。烟叶香型是烟叶质量和使用的重要依据和主要指标［5］。我国根据烟叶的香型特征，主要分3 个香型即浓香型、中间香型和清香型烤烟。其中，浓香型烤烟以河南烟区、湖南烟区为代表，中间香型烟叶以贵州烟区、黑龙江烟区为代表，清香型烟叶以云南烟区、四川烟区为代表［6-7］。有机酸广泛存在于烟草中，是烟草生长发育过程中的三羧酸循环产物，烟叶中的有机酸主要以非挥发性有机酸的形式存在，对烟草的生理代谢起着重要的作用［8-13］。烟草中的非挥发性有机酸虽然不能直接作用于烟叶的风味，但能与烟叶中的生物碱结合生成盐，从而调节游离烟碱的含量、使烟气的酸碱度得到平衡、烟气醇和，是影响烟草感官质量的主要物质之一［14-18］。已有研究表明，烟叶中的非挥发性有机酸主要影响烟叶感官质量评价指标中的刺激性、浓度和劲头［19-20］。

近年来，国内通过因子分析、判别分析和模糊数学理论等方法对烟叶质量与生态环境、烟叶产区关系的研究日益增多［21-23］。但是上述分析方法识别率低，不能很好地建立烟叶特征识别模型［24-26］。正交偏最小二乘判别（OPLS-DA 分析）可以用于确定不同类别分界面的最优位置，能够提高模型的预测效果，解释造成模式之间差异的根本原因，而且降低了对样本量的较高要求［27-29］。前人的研究多集中在不同香型单等级烟叶常规化学成分差异以及多酚类物质差异的比较，但是常规化学成分在不同香型间存在较多交叉，多酚类物质含量受海拔等因素影响较明显，且实验操作较复杂，检测指标过多，检测过程较繁琐。能够准确快捷、操作简便地区分浓香型多等级混合配打模块烟叶非挥发性有机酸含量的研究方法较少。

因此，以我国3 个香型8 个产区的33 个多等级配打模块烟叶为研究对象，基于正交偏最小二乘法判别分析，探索不同香型模块烟叶非挥发性有机酸含量的差异，并进行解释和分析，以期为浓香型模块烟叶风格定位和烟叶质量评价分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

选取2019 年来源于不同产区、不同香型的33个多等级配打模块烟叶样品，其中清香型模块9个，分别产自典型清香型产区四川、云南、福建3个省份；浓香型模块17 个，分别产自典型浓香型产区湖南、河南2 个省份；中间香型模块8 个，分别产自典型中间香型产区黑龙江、贵州、重庆3 个省份。所有样品均为多等级混合打叶后的片烟，经河南中烟工业有限责任公司技术中心收集后，统一复烤后制成。具体产地信息见表1。

浓硫酸、甲醇、二氯甲烷（AR，国药集团化学试剂有限公司）；己二酸（内标）、草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（色谱纯，美国百灵威公司）。

Agilent 6890 型气相色谱仪（美国Agilent 公司）。DHG-9145A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。标准筛（浙江省上虞市五四仪器筛具厂）。

表1 33 份样品的产地信息Tab.1 Producing area information of 33 samples

1.2 方法

1.2.1 样品处理

样品置于40 ℃烘箱2 h。烘干后混合均匀，用四分法取一部分样品磨成粉末过60 目（孔径：250 μm）筛，进行非挥发性有机酸的测定。

1.2.2 非挥发性有机酸含量的测定

非挥发性有机酸含量按照文献［18］的方法采用气相色谱法进行测定。

1.2.3 数据处理

1.2.3.1 描述统计和差异显著性分析

数据统计分析使用DPS7.05 软件。各成分所对应的字母代号分别为：草酸（X1）、丙二酸（X2）、α-戊酮酸（X3）、富马酸（X4）、丁二酸（X5）、苹果酸（X6）、2,4-庚二烯酸（X7）、柠檬酸（X8）、十六酸（X9）、亚油酸（X10）、油酸（X11）、十八酸（X12）、非挥发性有机酸总量（X13）。

1.2.3.2 正交偏最小二乘法判别分析

正交偏最小二乘法判别分析是基于变量X 构建变量Y 的预测模型。本试验中，非挥发性有机酸各指标为变量X，烟叶的不同香型为变量Y。使用SIMCA-P14.1 软件对分类后的样品非挥发性有机酸含量进行OPLS-DA 分析。

2 结果与讨论

2.1 烟叶非挥发性有机酸的统计描述

烟叶非挥发性有机酸的描述统计见表2。由表2 可以看出，α-戊酮酸（X3）、2,4-庚二烯酸（X7）、柠檬酸（X8）的偏度稍大，其余指标的偏度均较小，基本符合正态分布特征。α-戊酮酸、2,4-庚二烯酸和柠檬酸向右偏离中心稍远（偏度值＞1）。按照变异系数划分等级，丁二酸（X5）为弱变异性（变异系数≤10%），其余各指标均为中等变异性（变异系数在10%～100%）。

表2 烟叶非挥发性有机酸的描述性统计分析Tab.2 Descriptive statistical analysis of non-volatile organic acids in tobacco leaves

2.2 不同香型配打模块烟叶非挥发性有机酸含量差异显著性分析

对3 个香型配打模块烟叶非挥发性有机酸的13 个指标进行统计分析，结果见表3。由表3 可以看出，①草酸（X1）含量在不同香型配打模块烟叶间存在显著差异，清香型模块烟叶草酸含量显著低于浓香型模块和中间香型模块烟叶。②丁二酸（X5）含量在不同香型模块烟叶间存在极显著差异，中间香型模块烟叶丁二酸含量显著低于清香型模块和浓香型模块烟叶。③丙二酸（X2）、苹果酸（X6）、柠檬酸（X8）和亚油酸（X10）含量在不同香型模块烟叶间存在极显著差异，浓香型模块烟叶丙二酸、苹果酸、柠檬酸和亚油酸含量显著高于清香型模块和中间香型模块烟叶。④α-戊酮酸（X3）、富马酸（X4）、2,4-庚二烯酸（X7）、十六酸（X9）、油酸（X11）和十八酸（X12）的含量在不同香型模块烟叶间无显著性差异。非挥发性有机酸总量（X13）以浓香型模块烟叶最高，且与清香型模块和中间香型模块烟叶的差异达到极显著水平。综上所述，3 个香型配打模块烟叶在多个非挥发性有机酸指标上存在显著差异，这种差异可以用来区分配打模块烟叶风格特征。

表3 不同香型模块烟叶非挥发性有机酸含量差异显著性分析①Tab.3 Significant difference analysis of non-volatile organic acid content in tobacco leaves in modules with different flavor styles

2.3 不同香型配打模块烟叶非挥发性有机酸OPLS-DA 模型

对不同香型模块的烟叶样品非挥发性有机酸含量建立OPLS-DA 模型，筛选出了2 个预测主成分和3 个正交主成分。其中，R2X=0.77，表示5 个主成分对X 变量变异的解释能力为77%；R2Y=0.774，表示2 个预测主成分对Y 变量变异的解释能力为77.4%；Q2=0.627，表示2 个预测主成分对不同香型配打模块烟叶样品的预测能力为62.7%。一般来说，R2和Q2＞0.5 时，该模型的预测能力较好且模型较稳定。采用置换检验对模型的可靠性进行了验证，结果见图1。通过验证图可以看出，位于左侧的置换检验随机模型的Q2值均小于位于右侧原模型的Q2值，模型结果参数Q2的回归线与纵轴的截距为-0.474，小于0，表明模型较可靠，不存在过拟合现象。总的来说，模型的模拟效果较好。

图1 OPLS-DA 模型置换检验示意图Fig.1 Schematic diagram of permutation test of OPLS-DA model

图2 为基于非挥发性有机酸12 个指标的3 个香型配打模块烟叶33 个样品OPLS-DA 模型第1、2主成分得分图。由图2 可以看出，不同香型配打模块烟叶有明显聚集的趋势，不同香型配打模块烟叶可明显区分开来，其中横坐标为第一主成分得分，表明通过第一主成分可将浓香型模块烟叶同清香型模块和中间香型模块烟叶区分开；纵坐标为第二主成分得分，表明通过第二主成分可将清香型模块和中间香型模块烟叶区分开。本试验中，构建的OPLS-DA 模型能够较好地将3 个香型模块烟叶区分开，模型的模拟效果较好。

图2 OPLS-DA 模型得分图Fig.2 Score of OPLS-DA model

2.4 不同香型配打模块烟叶非挥发性有机酸分类指标筛选

图3 为OPLS-DA 模型中非挥发性有机酸各指标 的VIP（Variable Importance for the Projection）图。VIP 值越大，说明与香型差异的相关性越高，对解释变量的贡献率越大。图4 为OPLS-DA 模型第一主成分、第二主成分载荷图，表示了两个主成分非挥发性有机酸指标和不同香型配打模块烟叶的相关性，图中非挥发性有机酸指标与香型的距离越小，说明该指标对这个香型的相关性越高，影响越大。

图3 OPLS-DA 模型VIP 值Fig.3 VIP values of OPLS-DA model

图4 OPLS-DA 模型主成分载荷图Fig.4 Principal component load diagram of OPLS-DA model

由图3 可以看出，有6 个非挥发性有机酸指标对变量解释的贡献率较大（VIP＞1），按照贡献率由大到小的顺序排列分别为丁二酸（X5）、柠檬酸（X8）、苹果酸（X6）、丙二酸（X2）、亚油酸（X10）和草酸（X1）。由图4 可以看出，6 个对解释变量贡献率较大的指标丁二酸、柠檬酸、苹果酸、丙二酸、亚油酸和草酸均与浓香型较靠近，与清香型和中间香型相对较远，说明丁二酸、柠檬酸、苹果酸、丙二酸、亚油酸和草酸6 个指标与浓香型模块烟叶的相关性较高，与清香型模块和中间香型模块烟叶相关性相对较低，非挥发性有机酸对浓香型模块烟叶的影响高于清香型模块和中间香型模块烟叶。因此，非挥发性有机酸可作为浓香型模块烟叶区别于清香型模块和中间香型模块烟叶的主要化学成分。按照6 个指标与浓香型模块烟叶的距离由小到大排列，柠檬酸与浓香型距离最小，说明柠檬酸对浓香型模块烟叶的相关性最高，其次是丙二酸、苹果酸，6 个对解释变量贡献较大的指标中，草酸与浓香型模块烟叶的相关性相对较小。由表3 可以看出，经过OPLS-DA 模型筛选出来的与浓香型相关性较高的6 个指标在不同香型间均存在显著性差异，具有统计学意义，可以作为浓香型特征非挥发性有机酸指标。

3 结论

（1）不同香型模块烤烟非挥发性有机酸含量存在显著性差异。其中，浓香型模块烟叶草酸含量显著高于清香型模块烟叶；浓香型模块烟叶丙二酸、苹果酸、柠檬酸和亚油酸的含量高于清香型模块和中间香型模块烟叶；浓香型模块烟叶丁二酸含量显著高于中间香型模块烟叶；浓香型模块烟叶非挥发性有机酸总量显著高于清香型模块和中间香型模块烟叶。

（2）基于非挥发性有机酸建立的OPLS-DA 模型模拟效果较好，模型参数R2X、R2Y 和Q2分别为0.770、0.774 和0.627。

（3）通过模型得到的2 个主成分得分可较好地区分不同香型配打模块的烟叶。通过第一主成分可将浓香型模块烟叶同清香型模块和中间香型模块烟叶区分开；通过第二主成分可将清香型模块和中间香型模块烟叶区分开。

（4）通过模型筛选出VIP 值大于1 的6 个非挥发性有机酸指标（丁二酸、柠檬酸、苹果酸、丙二酸、亚油酸、草酸）与浓香型模块烟叶的相关性较大，6 个指标可作为浓香型模块烟叶的特征指标；影响浓香型模块烟叶的最主要指标依次为柠檬酸、丙二酸、苹果酸、亚油酸、丁二酸和草酸。