冯硕

摘  要：近红外荧光探针的发射波长能避免生物组织的干扰，对生物成像有较高的效率。文章对钯检测、N2H4检测、苯硫酚检测作为近红外荧光探针的合成、表征及具体在细胞中应用的分析。希望能为近红外荧光探针的更多应用和发展趋势做出不一样的分析方向。

关键词：近红外荧光探针;钯检测;N2H4检测;苯硫酚检测

中图分类号：O657.33        文献标志码：A         文章编号：2095-2945（2020）14-0095-02

Abstract： The emission wavelength of near-infrared fluorescence probe can avoid the interference of biological tissue and has high efficiency for biological imaging. In this paper， palladium detection， N2H4 detection， thiophenol detection as near-infrared fluorescence probe synthesis， characterization and specific application in cells were analyzed. It is hoped that it can make a different analysis method for more applications and development trends of near-infrared fluorescence probes.

Keywords： near-infrared fluorescence probe; palladium detection; N2H4 detection; thiophenol detection

多数荧光探针有着自身限制，具体表现为结构上和形态上的差异，所以大多数的荧光探针的发射波长被限制在了650nm之下，因此不能准确灵敏地去进行细胞内成分检测，会被样品的发射波长所干扰。

但近红外荧光探针在这方面有很好的改进之处，发射波长超过650nm，能够避免样本的自发荧光干扰，从而将荧光的化学分析和生物荧光成像做到高灵敏度，所以近红外荧光探针的应用越来越广，准确度也越来越高，帮助科研院所更快地取得了众多的成果研究。

1 近红外荧光探针的合成、表征

1.1 近红外荧光探针CyPd的合成、表征

1.1.1 探针CyPd的合成

在对探针CyPd的合成中，要在一个充分安全的环境保护下进行合成的操作，选用较为稳定的零摄氏度和安全气体氮来作为基础环境。将Cy化合物与三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下来将此混合溶液静置，把六甲酸稀丙酯滴进此溶液，为保证安全性与实验效果，需采用注射器的方式逐滴混合搅拌约30分钟，室温过夜。最后将此溶液进行减压蒸发得到固化物，此时的粗产品还需经过硅胶柱提纯则可得到探针CyPd，外形为蓝色固体。

1.1.2 探针CyPd的表征

在荧光成像分析中，可以看到探针CyPd的溶液颜色在不同的操作下有明显的变化。比如加入了缓冲溶液后，探针CyPd的荧光成像有明显的减弱趋势;在694nm的发射波长下，颜色由紫变蓝;发射波长为721nm时的感光强度最强，荧光成像图中呈现一波高峰。

1.2 近红外荧光探针DCMC的合成、表征

1.2.1 探针DCMC的合成

探针DCMC的合成依旧要在氮气保护下进行合成实验，目的是在探针DCMC的制取中隔绝氧气，以防止元素在氧气中产生氧化还原反应，影响实验的中间产物以致结果的不理想。将DCM的化合物與三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下来将此其中反应温度要控制在零摄氏度后静置，把乙酰氯溶液滴进此混合溶液，为保证安全性与实验效果，需采用注射器的方式逐滴混合，约预留出反应时间30分钟后进行减压蒸发得到固化物，此时的粗产品还需经过用占比为50份的二氯甲烷比1份的甲醇利用硅胶柱提纯法精提纯，则可得到探针DCMC，外形为黄色固体。

1.2.2 探针DCMC的表征

在荧光成像分析中，肉眼可见加入了探针DCMC的溶液颜色在不同的操作下有明显的变化。比如不同浓度的N2H4溶液在加入到探针DCM溶液中，颜色由淡黄变成紫红;另外根据荧光光谱来看，没加入N2H4，未显示有荧光反应和紫外线吸收现象;加入N2H4后，则有很强的荧光反应，借此证明了近红外荧光探针DCMC对N2H4的检测效果。

1.3 近红外荧光探针DCM-CHO-D的合成、表征

1.3.1 探针DCM-CHO-D的合成

探针DCM-CHO-D的合成要在氮气保护下进行，目的是在探针DCM-CHO-D的制取中防止各个活跃元素在含有氧气的反应环境中产生化学反应，以致实验结果的不严谨。将探针DCM-CHO-D与三乙胺都按顺序加入到二氯甲烷溶液中并使其充分溶解，将反应温度要控制在零摄氏度后静置得到溶液一。然后需要制备把2，4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷的混合溶液，得到溶液二，使用注射器把溶液二滴进溶液一中，在零摄氏度的反应温度下约预留出反应时间10分钟后，搅拌充分室温过夜。进行减压蒸发法得到固化物，此时的粗产品还需经过用到占比为50份的二氯甲烷比1份的甲醇作为洗脱剂，利用色谱硅胶柱提纯法精提纯，则可得到探针DCM-CHO-D，外形为红色粉末[1]。

1.3.2 探针DCM-CHO-D的表征

本实验所选的细胞为HeLa，进行目标细胞的选取后，将其置于96孔板中，期间要注意保证细胞的贴壁，培养时间控制在约24小时。然后用PBS溶液进行洗涤，洗涤次数三次为宜，加入探针DCMC做继续培养，时间控制在约30分钟，培养结束再次用PBS溶液进行三次洗涤，继而在显微镜下进行对HeLa细胞的荧光成像分析。接着再加入苯硫酚溶液在培养基中进行细胞孵育约30分钟，再次用PBS溶液进行三次彻底的洗涤，使培养基中能够去除残留的苯硫酚成分。最后用荧光显微镜对HeLa细胞荧光成像分析。

检测苯硫酚使用近红外荧光探针DCM-CHO-D，在加入了探针DCM-CHO-D后待测苯硫酚溶液颜色在不同的操作下有不同的变化。比如不同浓度的苯硫酚溶液在加入到探针DCM-CHO-D溶液中，颜色由淡黄变成粉红;另外根据荧光光谱来看，没加入大剂量的苯硫酚溶液前的缓冲液中，仅显示有较微弱的荧光反应和紫外线吸收现象;加入N2H4后，则有很强的荧光反应，在一定范围内苯硫酚的加入与荧光强度呈正相关。

2 近红外荧光探针的应用分析

2.1 近红外荧光探针对钯检测的应用分析

2.1.1 对钯检测的应用机理

钯检测是使用探针CyPd来作为近红外荧光探针的选择，探针CyPd其中有作为信号作用的CyH、起到识别作用的碳酸烯丙酯，二者的相互配合，将电荷的转移隔断，从而起到能够发射荧光波长和接收并吸收紫外照射的作用。荧光光谱的显示其实就是反映了待测样本其中的电荷移动趋势，当探针CyPd对钯的检测中，荧光光谱的波峰有明显的波动范围，说明探针CyPd对紫外线的吸收和对荧光的反射有较高的敏感度，进一步证明近红外荧光探针CyPd能够对钯检测的最终实验数据做充分的数据保证[2]。

2.1.2 应用于细胞中的检测

在对选用的HeLa细胞中的检测，为了防止细胞被损坏，可以进行不对细胞造成损害的细胞成像的影像技术来观察近红外荧光探针CyPd对钯检测的应用。首先要保持HeLa细胞的活性，不要对细胞膜的通透性产生影响，这样对钯的检测会出现数据偏差。实验检测在钯元素的不同价态下，作为是化合物的PdCl2是危害最大、毒性最强的存在，所以实验选择PdCl2作为HeLa细胞成像的关键要素。数据显示，在没有加入钯元素化合物前，荧光光谱未显示有荧光反应，在加入了PdCl2之后，荧光反应强烈。所以证明了近红外荧光探针CyPd对钯检测的实验中，探针CyPd对钯元素的检测及时且准确，而且很好地穿透了细胞膜且并未对细胞活性产生影响。

2.2 近红外荧光探针对N2H4检测的应用分析

2.2.1对N2H4检测的应用机理

探针DCMC对N2H4进行检测，是因为探针DCMC中含有信号集团和识别基团，分别是由DCM-OH负责发出信号、乙酰基负责识别信号作为对N2H4进行检测工作原理。近红外荧光探针DCMC里DCM-OH信号基团被识别基团乙酰基保护在内核部分，做荧光检测时，由于能够发出信号的DCM-OH被包含在内部，荧光发出波长但不能与分子内电荷发生反应所以会显示荧光猝灭;当检测成分中含有N2H4时，分子内的电荷可以与N2H4发生反应，所以会显示荧光发射和紫外线吸收的光谱图，进一步证明近红外荧光探针DCMC能够对N2H4检测[3]。

2.2.2 应用于细胞中的检测

在进行细胞成像中，可以从实验的进程里看出，在没有加入时，荧光光谱图未显示有荧光发射，而在加入微量N2H4后，就会有荧光发射和紫外吸收的现象发生。如果继续加大N2H4的剂量，荧光发射和紫外吸收的现象也会越明显，这样的实验结果有利于后续对人类的生产生活产生持续的重要影响。所以探针DCMC在检测中和细胞的兼容性很好，而且可以将活细胞中微量的检测成分N2H4也能清晰地展现出来，说明近红外荧光探针DCMC在生物活体上面做检测不会损害细胞活性。

2.3 近红外荧光探針对苯硫酚检测的应用分析

2.3.1 对苯硫酚检测的应用机理

探针DCM-CHO-D对苯硫酚能够进行检测是因为探针DCM-CHO-D中是由2，4-二硝基苯磺酸酯负责识别信号、DCM-CHO-OH负责发出信号作为对苯硫酚进行检测工作原理。探针DCM-CHO-D里DCM-CHO-OH信号基团被2，4-二硝基苯磺酸酯保护，做荧光检测时被切断了电荷的移动过程，所以荧光不会被发射;当加入苯硫酚时，苯磺酸酯与苯硫酚发生反应被水解，电荷可以进行转移引起了荧光发射和紫外线吸收的变化[4]。

2.3.2 应用于细胞中的检测

在对活细胞的苯硫酚检测中，对探针DCM-CHO-D进行细胞成像分析，发现加入苯硫酚之后荧光光谱显示红色荧光，未加之前细胞并未出现荧光。近红外荧光探针DCM-CHO-D在苯硫酚检测中细胞兼容性很好，说明探针DCM-CHO-D在生物活体上很友好，不会损害生物体细胞。

综上所述，以三类检测物进行具体分析近红外荧光探针的合成、表征及应用。探针CyPd可以对钯检测做出快速反应，探针DCMC可以将微量的N2H4高灵敏的检出，探针DCM-CHO-D能在保持细胞活性的基础上检测苯硫酚。未来近红外荧光探针的发展还需要新时代的科研人才去继续开发创造。

参考文献：

[1]张逢源，刘晓燕，叶为春.一种近红外荧光探针的合成、表征及应用[J].分析测试技术与仪器，2019，25（04）：228-231.

[2]于雪，包青青，姜超.花菁类近红外荧光探针在生物检测中的应用研究进展[J].化工进展，2019，38（12）：5492-5503.

[3]宋艳，黄文才，齐庆蓉.可用于肼检测的新型近红外荧光探针的合成及初步性能研究[J].华西药学杂志，2019，34（04）：325-331.

[4]苏伟.几种近红外荧光探针的合成表征及其实际应用[D].湖南师范大学，2017.