孙志斌，郜梦娇，孟雅莉，尚亚靖,亢延飞

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.河北北方学院 医学检验学院，河北 张家口 075000)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、半胱氨酸(cysteine,Cys)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)等生物硫醇在许多生理过程中起着关键作用，与多种疾病的发生密切相关[1-3]。人体缺乏半胱氨酸会导致肝损伤、嗜睡、肌肉与脂肪损伤、皮肤损伤和生长迟缓等问题[4-5]。同型半胱氨酸异常会引起肠炎、心血管疾病和神经系统疾病[6-7]。谷胱甘肽异常则是癌症和帕金森综合征的重要信号[8-9]。因此，准确、快速地检测和识别生物硫醇具有重要的生物学意义。由于Cys、Hcy和GSH的结构和化学性质的相似性，对它们的单一识别具有一定的重要意义。

近年来，荧光探针以其简便、高灵敏度、高选择性、低成本和实时成像等优点，成为检测生物硫醇的流行方法[10-12]。迄今为止，基于不同的传感机制，如与醛的环化反应[13-14]、与丙烯酸酯的共轭加成环化反应[15-22]、芳香取代重排反应[23-26]和迈克尔加成反应[27-28]等，开发出了多种检测Cys的荧光探针。其中，利用丙烯酸酯与Cys共轭加成环化反应检测生物硫醇是最热门的方法之一，该类探针利用丙烯酸酯的吸电子作用，使探针分子在激发态时出现PET(donor-excited photoinduced electron transfer)效应，从而引起荧光淬灭。而生物硫醇的引入导致分子内的丙烯酰基离去，PET效应被抑制，荧光团固有荧光得以发射。这类探针具有合成简单、检测限低、灵敏度高等优点，具有很好的实际应用价值。

本文中，将丙烯酸酯与(E)-2-(氨基甲基)-3-(6-羟基-2,3-二氢-1H-黄原-4-基)丙烯腈(CN-OH)结合，合成了一种用于检测Cys的荧光探针CN-NIR。探针以类花青素的CN-OH为荧光基团，丙烯酸酯为识别基团，通过Cys与丙烯酸酯共轭加成，进而发生1，6消除反应，生成环酰胺，使得荧光基团CN-OH得以释放的过程识别Cys(图1)。探针CN-NIR具有优异的荧光特性，与Cys作用后，610 nm处出现了新的紫外吸收峰，630 nm处的荧光强度显著增强，高选择和高灵敏地识别Cys。此外，它还能够有效地检测HeLa细胞中的Cys。

图1 探针CN-NIR对Cys和Hcy的可能响应机制

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(L-Lys)、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(L-Ile)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)和苏氨酸(Thr)。分析纯，北京百灵威科技有限公司。MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromid,购自Amresco)。所用化学药品全部来自供应商，未进一步纯化。所用溶剂以常规方法得以纯化和干燥处理。

Bruker-500型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)，以氘代氯仿(CDCl3-d1)和氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂，以四甲基硅烷为内标；UV-2550紫外分光光度计；F97pro型荧光光谱仪，通过3-D扫描选择激发波长；安捷伦Q-TOF 6520B型高分辨质谱仪(美国安捷伦公司)，电喷雾离子源(ESI)；酶标仪(Bio-Rad 680M)；荧光显微镜(Olympus BX41)。

1.2 探针的合成(图2)

图2 探针CN-NIR的合成路线

1.2.1 化合物1的合成[29]

在0 ℃下，向N，N-二甲基甲酰胺(11.2 mL)和氯仿(50 mL)的混合物中逐滴加入三溴化磷(12.4 mL)，搅拌45 min后，加入环己酮(5 mL)。室温反应16 h，将其倒入50 mL冰水中，用碳酸氢钠中和。然后用二氯甲烷(50 mL)萃取3次，有机相加入适量无水硫酸钠进行干燥，除去溶剂，得到黄色油状物，用于下一步反应。

1.2.2 化合物2的合成[29]

1.2.3 化合物3的合成[30]

1.2.4 化合物CN-OH的合成[29]

1.2.5 探针CN-NIR的合成[31]

1.3 细胞毒活性及细胞成像

1.3.1 MTT法[32]

HeLa细胞以5×104cells·mL-1的密度接种在96孔板中，于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h。然后加入不同浓度的探针CN-NIR，并于培养箱中培养24 h。随后加入100 M MTT溶液(0.5 mg·mL-1)，于37 ℃避光孵育4 h。最后吸除没有完全反应的MTT溶液，加入100 μL DMSO溶解生成甲瓒产物，在570 nm处测定A值。细胞存活率计算如下

细胞存活率(%)=加探针组A/对照组A×100%

1.3.1 细胞成像

图3 探针CN-NIR(20 μM)与同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)(200 μM)反应的紫外吸光光谱

细胞成像前，HeLa细胞接种在24孔板中，于5% CO2、37 ℃的培养箱中孵育24 h。作为参照实验，向一部分HeLa细胞加入20 μM探针CN-NIR并孵育30 min;用 PBS缓冲液清洗细胞3次。用荧光显微镜观察，发现HeLa细胞发出红色荧光。另一部分HeLa细胞在加入20 μM探针CN-NIR之前，先用1 mM N-乙基马来酰亚胺(NEM，良好的生物硫醇抑制剂)预处理30 min，荧光显微镜下发现细胞几乎没有荧光。在被NEM处理的含有荧光探针的HeLa细胞中加入500 μM的半胱氨酸，于37℃继续孵育30 min，用PBS缓冲液清洗3次，用荧光显微镜进行细胞成像。

2 结果与讨论

2.1 光谱性质

在磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.4,20% DMF)体系中，室温条件下，探针CN-NIR的紫外吸收光谱实验表明：CN-NIR自身在480 nm处有明显的吸收峰，加入Cys后，在610 nm处出现了新的吸收峰(图3)，说明CN-NIR与Cys发生了反应，生成了新的物质；随着Cys浓度的增加，480 nm处吸收峰强度逐渐减弱，610 nm处吸收峰强度逐渐增大，610 nm和480 nm(A610/A480)处的吸收比率与Cys浓度呈良好的线性关系(R2=0.996)(图4～5)，同时可以明显地观察到溶液的颜色由粉色变为紫色。说明探针CN-NIR在可见光区可以有效地识别Cys。

图4 探针CN-NIR(20 μM)与Cys(0～200 μM)反应的紫外吸收光谱 图5 探针CN-NIR(20 μM)与Cys(0～200 μM)反应在610/480 nm处的吸光度之比

图6 CN-OH(20 μM)、CN-NIR(20 μM)、CN-NIR(20 μM)与Cys(200 μM)反应5 min的荧光光谱

CN-NIR与Cys反应的荧光光谱如图6所示。在600 nm波长激发下，探针CN-NIR溶液几乎没有荧光，这可能是酚氧原子上的孤对电子转移到处于激发态的类花青素环，存在光诱导电子转移效应(PET效应)，导致荧光猝灭。当加入Cys后，630 nm附近的近红外荧光强度显著增强，是因为Cys与丙烯酸酯发生加成环化反应而释放出荧光基团CN-OH，电子跃迁受阻，PET效应消失使得荧光团的荧光恢复。

为了研究探针CN-NIR对Cys检测的灵敏度，进行了荧光滴定实验。发现随着Cys浓度的增加，630 nm处的荧光强度逐渐增加，当Cys用量为10当量时，荧光强度达到最大值，该过程还伴随着溶液颜色的明显变化(图7～8)。同时，荧光强度与Cys浓度(0～140 μM)呈现良好线性关系(R2=0.991)(图7)。根据S/N=3，计算出探针CN-NIR对Cys的检测限为1.03 μM，该值远低于细胞中Cys的正常含量(30～200 μΜ)[15]。因此，探针CN-NIR可以灵敏地检测活细胞中的Cys。

图9 探针CN-NIR(20 μM)与Cys(200 μM)、Hcy(200 μM)和GSH(200 μM)反应的荧光光谱

2.2 探针CN-NIR对Cys的选择性识别

由于Hcy、GSH和Cys结构和化学性质的相似性，Hcy和GSH是Cys检测中最大的干扰因素。为此，首先研究了探针CN-NIR对Cys、Hcy和GSH的选择性。在相同条件下，向探针CN-NIR溶液中加入Hcy或GSH只会引起较小的荧光变化。结果表明，CN-NIR对Cys的识别选择性高于Hcy和GSH(图9)。

然后考察了探针CN-NIR(20 μM)对其他17种氨基酸((L-Lys、L-Ile、L-Ala、L-Phe、L-Glu、L-Tyr、Gly、L-Leu、L-Try、Ser、DL-Met、L-Asp、L-Val、L-His、L-Thr、L-Arg、L-Pro 200 μM)和可能引起干扰的金属离子(Na+,Mg2+,Ba2+,Zn2+,Cu2+,Fe3+200 μM)的荧光响应情况。如图10所示，除了Hcy和GSH外，其他氨基酸和金属离子的加入，几乎没有引起探针荧光强度的变化。Hcy和GSH，由于其结构和化学性质与Cys有一定的相似性，荧光强度略有所增强，但并不造成干扰。这说明探针CN-NIR能够选择性地单一识别Cys。

为了更进一步研究探针在其他共存氨基酸及金属离子条件下对Cys的识别能力，进行了竞争实验。如图11所示，在加入等量的各竞争分析物种后，探针与Cys反应的荧光强度并未发生明显的变化，说明在共存物种干扰下，探针仍然可以有选择性地识别Cys。

图10 探针CN-NIR(20 μM)与各种分析物(200 μM)反应的荧光光谱 图11 探针CN-NIR(20 μM)与各种分析物(200 μM)和Cys(200 μM)共同反应的荧光强度

图12 探针CN-NIR(20 μM)与Hcy(200 μM)、Cys(200 μM)和GSH(200 μM)的时间依赖性荧光响应

为了更有效地说明探针能够避开Hcy和GSH的干扰，单一识别Cys，还测定了探针CN-NIR对Cys、Hcy和GSH的响应时间。加入Cys后，探针在630 nm处的荧光强度迅速增加，并在5 min内达到平台，而加入Hcy和GSH所引起的荧光强度变化不仅弱于Cys且需要更长的时间才能到达稳定(图12)。结果表明，探针CN-NIR能够单一识别Cys。计算Cys、Hcy和GSH(10当量)与CN-NIR反应的假一级反应速率常数发现CN-NIR与Cys的速率常数(0.76 s-1)，远大于与Hcy(9.40×10-2s-1)和GSH(8.40×10-2s-1)的速率常数，更进一步地说明了探针能够有效地选择性识别Cys。

在可见光条件下，可以通过CN-NIR与各干扰物种反应的颜色变化将Cys与其他分析物区分开。CN-NIR与Cys反应的溶液呈紫色，而与Hcy、GSH、L-Lys、L-Ile、L-Ala、L-Phe、L-Glu、L-Tyr、Gly、L-Leu、L-Try、Ser、DL-Met、L-Asp、L-Val、L-His、L-Thr、L-Arg、L-Pro、Na+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+反应的溶液呈粉红色。这说明CN-NIR可以裸眼识别Cys(图13)。

图13 可见光条件下，CN-NIR(20 μM)与每个分析物(200 μM)反应后的颜色变化

2.3 pH值对探针CN-NIR和Cys反应的影响

为了研究探针CN-NIR对Cys的识别是否适用于生理条件，研究了pH值对探针CN-NIR和Cys反应的影响。结果表明，探针CN-NIR自身在较宽的pH范围内(4～11)都比较稳定，当探针CN-NIR和Cys反应时，体系的pH值大于6后，探针的荧光强度显著增强(图14)，探针CN-NIR在生理pH值附近工作良好。因此，该探针可以在生理条件下有效地识别Cys。

图14 pH对探针CN-NIR检测Cys的影响 图15 探针CN-NIR处理HeLa细胞24 h的毒活性

图16 探针CN-NIR在HeLa细胞中的荧光显微镜图像

2.4 细胞成像

鉴于上述结果，探针CN-NIR对Cys的识别具有较高的选择性和灵敏度，将其在细胞体中进行实际应用。首先，采用MTT法，评价探针CN-NIR抑制HeLa细胞的增殖活性。实验结果表明，CN-NIR(0～40 μM)对HeLa活细胞具有非常低的细胞毒性(图15)。接着，进行了一系列比较实验，以证实探针CN-NIR可以检测细胞内的Cys。HeLa细胞自身没有荧光，当HeLa细胞与探针CN-NIR(20 μM)孵育30 min时，可以观察到红色荧光，这可能是由内源性Cys引起的。作为对照实验，用N-乙基马来酰亚胺(NEM 1 mM)预处理细胞30 min，以除去内源性Cys，然后再用CN-NIR(20 μM)孵育细胞30 min，细胞几乎没有荧光。用NEM预处理HeLa细胞后，用Cys(500 μM)孵育30 min，再用CN-NIR(20 μM)孵育30 min后，细胞呈现出更强的红色荧光(图16)。这表明，探针CN-NIR可以用于检测活细胞内的Cys。

3 结论与讨论

生物硫醇小分子如Cys、Hcy及GSH在生物体系中维持氧化还原平衡以及细胞功能中扮演了重要的角色，选择性检测其中一种硫醇小分子具有十分重要的意义。设计并合成了一种基于Cys与丙烯酸酯共轭加成环化反应的近红外荧光探针CN-NIR。紫外吸收光谱中，探针CN-NIR与Cys反应后出现了新的吸收峰，并且伴随溶液颜色的明显变化，说明探针CN-NIR在可见光区可以有选择地识别Cys。荧光发射光谱研究发现，探针CN-NIR能够有效地避开结构和化学性质与Cys相似的Hcy和GSH的干扰，高选择性和高灵敏地单一识别Cys，检测限低至1.03 μM。更重要的是，探针CN-NIR能够应用于活细胞中Cys的检测。