杨 靖，陈志刚，张苗靖，吴建虎，戎友燕，宋艺超，武晋海，

（1.山西师范大学食品科学学院，山西临汾 041000；2.山西省孝义市林业局，山西孝义 032301；3.山西师范大学现代文理学院，山西临汾 041000）

柿蒂（Diospyros kakiThumb.）别名柿丁，为柿科植物柿的干燥花萼，扁圆形，基部有果梗痕；外表面呈黄褐色或红棕色，内表面呈黄棕色，密被细绒毛，质硬而脆，主产于四川、广西、福建等地。其味苦、性温，具有降气、止反胃、呕吐及呃逆的功能，研究发现，柿蒂的提取物还具有镇静、抗心律失常、抗生育的作用。柿蒂的主要有效成分为有机酸类化合物、萜类化合物、糖类化合物等，其中含量最高的有机酸是熊果酸和齐墩果酸。研究人员在柿蒂化学成分的分离与鉴定的研究中用70%甲醇提取柿蒂中有效成分，首次分离得到4种萜类化合物化合物，其中包括2,4-羟基齐墩果酸、2,4-二羟基熊果酸。

齐墩果酸（Oleanolic acid,OA），又名庆四素，是一种五环三萜类化合物，以游离或与糖苷结合成苷的形式，具有保肝、降糖降脂、抗诱变抗癌[1]、调节免疫、抗菌抗病毒、抗炎、抗高血压等作用。熊果酸（Ursolic acid，UA），又名乌索酸、乌苏酸、α-香树脂醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物，具有毒性低、毒性周期短的特点，也是一种毒副作用较小的天然药物，具有抗肿瘤作用、抗心血管疾病作用，以及保肝、抗肝炎作用。

目前，关于柿蒂中熊果酸和齐墩果酸的提取研究较少。虽然国内柿蒂产量大，但生产加工上易造成资源浪费，加之其主要活性成分为三萜酸[2]。采用微波法辅助乙醇提取柿蒂中熊果酸和齐墩果酸[3-4]，经蒸发浓缩后，采用高效液相色谱[5]（HPLC） 法对提取量进行检测，再用正交试验法对其提取工艺条件进行优化[6-11]，为柿蒂保健功能的研究、应用及开发具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柿蒂，河南省一等，购自北京同仁堂临汾连锁药店。

1.2 仪器与设备

超微粉碎机、微波炉、色谱柱等。

1.3 试验方法

1.3.1 柿蒂的预处理

干燥至恒质量，将其放置于超微粉碎机中粉碎，过100目筛，得柿蒂粉。保鲜膜封存于干燥烧杯，低温贮藏，备用。

1.3.2 柿蒂中熊果酸和齐墩果酸的提取过程及方法

参考刘仙俊等人[12]采用微波辅助乙醇溶剂提取方法。精确称取2.00 g柿蒂粉分别置于250 mL的锥形瓶中，按照不同因素组成方案，加入相应的乙醇体积分数，然后放置柿蒂溶液到微波炉中，通过不同的微波条件进行微波提取处理。

1.3.3 单因素试验

（1）料液比的最佳条件分析。固定乙醇体积分数80%，提取时间90 s，微波功率300 W，设置料液比分别为 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，根据结果分析，确定最佳料液比。

（2）乙醇体积分数的最佳条件分析。固定提取时间90 s，微波功率300 W，料液比1∶20，设置乙醇体积分数分别为50%，60%，70%，80%，90%，根据结果确定最佳乙醇体积分数。

（3）提取时间的最佳条件分析。固定料液比1∶20，乙醇体积分数80%，微波功率300 W，设置提取时间分别为30，60，90，120，150 s，根据结果确定最佳提取时间。

（4）微波功率的最佳条件分析。固定乙醇体积分数80%，料液比1∶20，提取时间90 s，设置微波功率分别为100，200，300，400，500 W进行微波处理，根据结果确定最佳微波功率。

1.3.4 正交试验

通过单因素试验[9-10]，确定了乙醇体积分数、料液比、提取时间、微波功率最佳参数。为确定其4种因素对柿蒂中熊果酸和齐墩果酸提取量的综合影响，采用L9（34）的正交设计，其中以熊果酸和齐墩果酸的提取含量为理化指标。

1.4 柿蒂中熊果酸和齐墩果酸含量的测定

1.4.1 熊果酸和齐墩果酸提取物浓缩处理

经微波处理样品，用冰水迅速冷却，然后将其转移到水浴恒温振荡器中，转速150 r/min，振荡时间40 min，水浴温度24℃。振荡结束后，将样品快速转移至50 mL的离心管中，用5 mL无水乙醇洗涤容器，洗涤3次，将提取物完全洗涤至离心管中。将每组柿蒂液转移至离心管后离心，设定其温度为室温，以转速4 500 r/min离心10 min。离心上清液转入旋转蒸发仪蒸馏圆底烧瓶，温度设置为43℃，转速为75 r/min，蒸发干所有的乙醇，结束操作。

1.4.2 样品的制备方式

熊果酸和齐墩果酸提取物浓缩处理后，蒸馏圆底烧瓶内含有柿蒂的待测物质，为了防止其放置时间过久，将其紧贴在瓶内，即刻用10 mL甲醇（分析纯）洗涤蒸馏圆底烧瓶，用手工用力摇晃，使其完全洗涤溶解，此过程进行2次，最终将2次的洗涤液都即刻转移到25 mL的容量瓶中，然后再定容至刻度线，充分摇匀，完全溶入即得到样品溶液。

1.4.3 熊果酸和齐墩果酸两种标准品溶液的配制方式

参照古力齐曼·阿布力孜等人[10]、用电子天平精确称取熊果酸和齐墩果酸标准品2.00 mg，然后将其放在100 mL的小烧杯，用甲醇（分析纯）溶解，用玻璃棒彻底搅拌使其完全溶解，再用玻璃棒引流到10 mL容量瓶中，最后定容至刻度线，充分摇晃均匀后，备用。

1.4.4 熊果酸和齐墩果酸试样的测定

（1） 参照王敏、任彦荣、陈军、吴玲等人[13-16]的方法确定色谱条件。色谱柱为1PDA柱（Multi，6 μm，210 nm×4 nm），流速 1.5 mL/min，流动相为甲醇（色谱醇） ∶水∶醋酸=90∶10∶0.2，柱子温度24℃，其中检测波长为210 nm。

（2） 试样的测定[17-18]。用有机微孔过滤膜过滤样品液，然后再进行取样，用取样器取适当滤液，其中进样量为5 μL，在色谱条件下进行柿蒂中熊果酸和齐墩果酸的含量测定。

1.4.5 样品中2种有机酸的测定

（1） 测定方法。

式中：C——高效液相色谱法检测到的熊果酸和齐墩果酸分别的浓度；

V——定容体积（25 mL）；

m——样品质量（2 g）。

2 结果与分析

采用DPS数学软件V15.10进行分析统计。

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响

探究料液比的最佳条件[19-20]，固定乙醇体积分数80%，提取时间90 s，微波功率300 W，设置料液比分别为 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 进行单因素试验。

料液比对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响见图1。

从图1可看出，从1∶5以5的阶梯连续加到1∶20的料液比范围内，伴随着料液比的递增，熊果酸和齐墩果酸的总含量有微小的递增趋势，直到料液比为1∶20时，2种有机酸的总提取量达到最高，其含量为1.027 mg/g；随着料液比的继续增加，达到1∶25时，熊果酸和齐墩果酸的总含量开始呈下降趋势，这大概是因为熊果酸和齐墩果酸的提取已比较充分，继续增加料液，含量没有多大的变化，反而增加了浓缩时间，损失量相对也会增加。所以，过大的料液比会导致总提取量下降，因此最终选择1∶20的料液比作为最佳料液比。

2.1.2 乙醇体积分数对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响

探究乙醇体积分数的最佳条件[21]，固定提取时间90 s，微波功率300 W，料液比1∶20，设置乙醇体积分数50%，60%，70%，80%，90%进行单因素试验。

乙醇体积分数对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响见图2。

从图2可看出，当乙醇体积分数为50%时，2种有机酸的总提取量相对较低；乙醇体积分数增加到60%和70%时，总提取量呈显著性增加趋势；继续提高乙醇体积分数到80%，总提取量几乎达到了最高0.987 mg/g，但是当乙醇体积分数达到90%时，熊果酸和齐墩果酸的总提取量却开始呈略微下降趋势，但是相差不大，没有显著性降低；随着乙醇体积分数的升高，增加了对2种有机酸的溶解力，所以具有相对较高的提取量。所以，最终选择使提取量最高的乙醇体积分数为80%作为最佳。

2.1.3 提取时间对熊果酸和齐墩果酸的总提取量的影响

探究提取时间的最佳条件[22]，固定料液比1∶20，乙醇体积分数80%，微波功率300 W，提取时间设置为30，60，90，120，150 s进行单因素试验。

提取时间对熊果酸和齐墩果酸的总提取量的影响见图3。

从图3可看出，提取时间为30 s时，已经达到了相对较高的总提取量1.386 mg/g；当微波提取时间增加到90 s，依然呈现下降趋势，但是下降的势头不是很明显。原因可能是由于随着微波加热时间过长，里面的一些其他黏度较高的物质会慢慢析出来，附着在柿蒂表面，不容易被提取出来，所以随着提取时间延长，熊果酸和齐墩果酸的总提取量开始降低。经综合考虑，选取微波提取时间30 s为最佳提取时间。

2.1.4 微波功率对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响

探究提取微波功率的最佳条件[23]，固定乙醇体积分数80%，料液比1∶20，提取时间30 s，微波功率设置为100，200，300，400，500 W，然后依据上述条件进行单因素试验。

微波功率对熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响见图4。

从图4可看出，微波功率为100～200 W时，总提取量呈略微上升趋势；但是达到300 W时，最高总提取量为0.656 mg/g；随着微波提取功率的增加，柿蒂中的熊果酸和齐墩果酸的总提取量略微下降。可见，微波功率过高，受热容易分解，会破坏2种有机酸的总提取量。所以最终选择微波提取功率300 W。

2.2 正交试验

由单因素试验结果可以看出，料液比、乙醇体积分数、提取时间、微波功率都不同程度地影响着柿蒂中齐墩果酸和熊果酸总提取率。因此，每次用柿蒂粉2.000 0 g，对料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C） 和微波功率（D） 4个主要因素进行正交试验。

熊果酸和齐墩果酸正交试验设计因素与水平设计见表1，熊果酸和齐墩果酸总提取量的结果与分析见表2。

表1 熊果酸和齐墩果酸正交试验设计因素与水平设计

表2 熊果酸和齐墩果酸总提取量的结果与分析

通过正交试验结果的分析，可以明显地看到4个因素的极差结果，料液比、乙醇体积分数、提取时间、微波功率对极差值R分别是0.705，0.253，0.596和0.161，因此，这4个因素对熊果酸和齐墩果酸的提取量的影响顺序依次为料液比＞提取时间＞乙醇体积分数＞微波功率，即A＞C＞B＞D。由以上排序知道，料液比对熊果酸和齐墩果酸提取量的影响最大，其次是提取时间，料液比的影响不大，但是料液比和乙醇体积分数对2种有机酸提取量的影响相差较大，影响效果最小的是微波功率。所以，最佳组合为 A3B3C3D3，即料液比 1∶25，乙醇体积分数85%，提取时间90 s，微波功率400 W，用该试验指标提取柿蒂中熊果酸和齐墩果酸的工艺提取，最终提取量为1.615 mg/g。

熊果酸和齐墩果酸总提取量的方差分析见表3。

表3 熊果酸和齐墩果酸总提取量的方差分析

由表3可以看到，料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C），对2种有机酸的总提取量有很大的影响，其中F值能够体现出这4个试验因素对于熊果酸和齐墩果酸的总提取量的影响，F值与影响大小成正比。其中，F（A）=187.622，F（B）=161.044，F（C）=152.102，由之前的极差值R可以得出，微波提取功率对于熊果酸和齐墩果酸总提取量的影响最小，几乎可以不计。综上所述，上述4个试验因素对于熊果酸和齐墩果酸的总提取含量的影响次序为料液比＞提取时间＞乙醇体积分数＞微波功率。所以，根据这个试验与已经存在的一些研究报道相比在医药方面具有一定的价值。

2.3 验证试验

按上述最佳工艺条件进行验证试验，重复3次，柿蒂齐墩果酸和熊果酸总提取量分别为1.609，1.617，1.626 mg/g，平均值为1.617 mg/g，高于正交设计表中任一提取工艺的试验结果，说明通过正交试验得出的优化条件稳定、可靠[24]。与已有的研究报道相比，试验结果具有一定的应用价值。

2.4 误差分析

试验与之前报道过的柿蒂中熊果酸和齐墩果酸提取量有一定的差距，这可能与试验过程中的操作失误有关，比如在制作样品过程中，定容至10 mL，均使用无水乙醇，而没有选择单因素固定的乙醇体积分数。还有可能是因为样品制作完成后，没有立刻测量，中间相隔了几天，导致测量出来的含量总体不高。

3 结论

采用微波法辅助提取柿蒂中熊果酸和齐墩果酸，首先是进行单因素试验，选择4个因素的最佳水平，然后再进行正交试验，最终优化提取工艺，得到最佳组合为料液比1∶25，乙醇体积分数85%，提取时间90 s，微波功率300 W。通过该最佳组合进行试验，最终得到熊果酸和齐墩果酸总提取量1.615 mg/g，有效实现了提取量最大化。