张书琳，刘文文，何爱玲，崔圣莹

（1.山东第一医科大学临床医学院，山东 泰安 271000；2.山东第一医科大学基础医学院，山东 泰安 271000；3.泰山疗养院检验科，山东 泰安 271000；4.山东第一医科大学教务处,山东 泰安 271000）

近年来，染发已成为人们的一种时尚选择。大部分男性留短发，其染发的频率要高于女性。部分有染发习惯的男性会每隔15～30 d染发1次。目前，市售染发剂主要可分为永久染发剂、半永久染发剂、脱色染发剂、临时染发剂四大类。这些染发剂的染色原理不尽相同，但其主要成分均为对苯二胺(PPD)与双氧水(H2O2)。这两种成分的混合物对人体内的多种细胞均具有致畸变的作用。除此之外，染发剂中还含有铅等有害物质。流行病学调查显示，多种疾病的发生均可能与使用染发剂有关。相关的研究指出，染发剂可能对人体内的生殖细胞产生致畸变作用，从而影响生育。为了探讨长期使用染发剂对生殖功能的危害，笔者进行了有关染发剂致小鼠精子畸形的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取30只SPF级昆明种健康成年雄性小鼠（由山东第一医科大学临床医学院实验动物中心提供，周龄为6～7周，体重为20～25 g）作为研究对象。将其饲养于独立的通风换气笼中，并将换气笼中的温度控制在20～25℃之间，将换气笼中的湿度控制在50%～70%之间）。本研究经山东第一医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 仪器、试剂和染发剂 本研究中所用的仪器、试剂和染发剂主要包括：恒温水浴箱（购自天津市惠达实验仪器有限公司）、显微镜（购自北京瑞宏诚科技有限公司）、血细胞计数板（购自北京瑞宏诚科技有限公司）、凡士林（购自东莞康尔维医药科技有限公司）、伊红染料（购自河北博海生物工程开发有限公司）、甲醇（购自衡水广康商贸有限公司）、生理盐水（购自衡水广康商贸有限公司）、植物永久性染发剂（由广州某化妆品公司生产，批准文号：国妆特字G20120404）、氧化永久性染发剂（由广州某化妆品公司生产，批准文号：国妆特字G20121106）。

1.2 染毒方法

采用完全随机法将上述30只小鼠分为植物永久性染发剂组、氧化永久性染发剂组和对照组。为植物永久性染发剂组小鼠、氧化永久性染发剂组小鼠分别用植物永久性染发剂、氧化永久性染发剂进行染毒。方法是：按染发剂说明书中的配制方法配制染发剂，然后将其均匀地涂抹于小鼠的背部（涂抹面积为3 cm×3 cm）。染毒剂量为5 mg/g，每隔2 d染毒1次，连续染毒7次。为对照组小鼠在背部涂抹等量的凡士林，涂抹方法与上述染毒方法相同。

1.3 精子畸形率的测定方法

将三组小鼠于首次染毒或涂抹凡士林后的第30 d用颈椎脱臼法处死，剖开其腹腔，暴露其睾丸，分离其双侧附睾。然后将附睾标本放入盛有4 ml温度为37℃生理盐水的小平皿中。将小平皿置于37℃的恒温水浴箱中（放置时间为20 min），使精子充分游离于生理盐水中，形成精子悬液。然后取适量的精子悬液置于载玻片的一侧，取另一片载玻片为推片，制作精子涂片。待涂片干燥后，将其放入甲醇溶液中固定5 min，然后取出晾干。用2%的伊红水溶液对涂片进行15～20 min的染色，再用蒸馏水对其进行冲洗。在显微镜下对每组小鼠精子涂片上的500个精子进行观察，并统计其中畸形精子的数量。精子畸形的主要类型包括：胖头、尾折叠、无钩、香蕉形、无定形、双头及双尾等。无尾精子、头部重叠或整个重叠的精子均不计数。精子的畸形率=精子畸形数/500×100%。

1.4 精子计数的测定方法

分别取每只小鼠的精子悬液10 μl，将其滴入血细胞计数板中。使精子悬液缓慢地流入计数室内。静置5 min后将计数板放于显微镜的载物台上，待精子不再游动后计数。在低倍镜下找到计数室的中央大方格后，在高倍镜下对每个计数室中左上、左下、中央、右上、右下大方格内的精子进行计数，再求得每个大方格中精子的均数，最后得出小鼠每毫升精液中的精子数。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件分析本研究中的数据，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠的一般情况

三组小鼠在整个实验期间精神活动状态无异常，体重均有所增加。三组小鼠体重增长的幅度相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 三组小鼠精子畸形的情况

植物永久性染发剂组小鼠和氧化永久性染发剂组小鼠精子的畸形率均高于对照组小鼠，差异有统计学意义(P＜0.01)。植物永久性染发剂组小鼠与氧化永久性染发剂组小鼠精子的畸形率相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。详情见表1。

表1 三组小鼠精子畸形的情况

2.3 三组小鼠的精子计数

三组小鼠的精子计数相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。详情见表2。

表2 三组小鼠的精子计数（×106/ml，）

表2 三组小鼠的精子计数（×106/ml，）

分组 只数 精子计数植物染发剂组 10 11.62±3.05氧化染发剂组 10 9.21±2.74对照组 10 13.36±5.48

3 讨论

近年来，随着染发剂的广泛使用，有关染发剂毒性的研究报道逐年增多。有很多专家学者对染发剂致小鼠精子畸形的作用进行了实验研究。王丽丽等[1]研究发现，用氧化型染发剂对小鼠进行染毒处理会增加其精子的畸形率。吴雨龙等[2]的研究证实，氧化型染发剂对雄性小白鼠的精子具有致畸变的作用。相关的流行病学调查发现，卵巢癌、膀胱癌的发生与患者长期使用染发剂存在一定的关联性[3]。精子畸形是指精子的形态异常。精子的畸形率与精子计数是反映精液质量的重要指标。精子畸形率的增加与精子计数的减少是雄性小鼠生殖功能受损的重要特征之一。有研究指出，经染发剂染毒处理后的小鼠其精子畸形的主要类型包括胖头、尾折叠、无钩、香蕉形、无定形、双头及双尾等[4]。其中尾折叠畸形最为常见，其次为胖头畸形，而双头及双尾畸形则较为少见[5-6]。本研究的结果显示，植物永久性染发剂组小鼠和氧化永久性染发剂组小鼠精子的畸形率均高于对照组小鼠，差异有统计学意义(P＜0.01)。

综上所述，用植物永久性染发剂和氧化永久性染发剂对小鼠进行染毒处理均会增加其精子的畸形率。