倪 萍，刘月琴，李 旺，苏兆亮，周成林*

（1.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300； 2.江苏大学免疫学研究所，江苏 镇江 212013；3.江苏大学第四附属医院，江苏 镇江 212001）

乳腺癌是威胁女性身心健康的一种常见恶性肿瘤，目前关于乳腺癌的发病机制及病因尚未明确阐述。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，其参与了肿瘤细胞的生殖、分化过程；而MDSC具有显著的抑制免疫细胞应答的能力[1]。研究表明，乳腺癌患者中HMGB1表达情况与MDSC具有一定关联性，但目前相关报道相对较少[2]。鉴于此，本研究主要分析乳腺癌中HMGB1表达与MDSC的相关性，旨在指导临床预测乳腺癌的发生风险。

1 材料与方法

1.1 材料

荧光定量P C R 试剂盒（大连宝生）；H M G B 1抗体（Abcam）、GAPDH抗体（南京凯基）；PCR引物（广州复能）；PE-anti-CD11b抗体、FITC-anti-Gr-1抗体（BD）。 BALB/C裸鼠，扬州大学动物中心购得。人乳腺癌MCF-7细胞系来自本研究室。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤鼠模型的建立

BALB/C裸鼠肩胛区皮下注射MCF-7 106-107细胞0.3 mL，2周后取肿瘤组织、脾脏和外周血。

1.2.2 流式细胞仪

将1×106细胞加入25 μLPBS中，分别加FITC标记的Gr-1抗体1 μL和PE标记的CD11b抗体2.5 μL，冰上孵育30 min，然后加入1 mL PBS，离心，重复2次。最后加200 μL PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测。

1.2.3 Western blot

10 g/L PMSF的裂解液制备总蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；PVDF转膜，脱脂奶粉封闭；HMGB1抗体（1：1000）4°C孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1：5000）孵育2 h，ECL法显色，用Bio-RAD凝胶成像系统来检测蛋白条带。

1.2.4 RT-qPCR

提取总RNA后逆转录成cDNA，RT-qPCR检测HMGB1表达，GAPDH作为内参照。25 μL体系，扩增条件为：95°C预变性15秒，95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸15秒，共40个循环。

1.3 统计学方法

Graphpad Prism5软件进行数据分析，两组比较采用Student’s t检验，Pearson分析相关性，P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MDSC的检测

荷瘤鼠脾脏和外周血中MDSC的比例高于正常对照组，差异有统计学意义（***为p＜0.001）,见图1。……