宫田娇 张 月 李 雪 朱兴友 周成利 刘隽彦 朴玉兰*

(1.吉林省蚕业科学研究院，吉林吉林 132012；2. 德惠市水稻生产工作站，吉林德惠 130300)

柞蚕属食疗同源昆虫，我国养殖利用柞蚕已有2 000多年，柞蚕是我国重要的生物资源[1]。表皮生长因子受体(EGFR)是一个巨大的跨膜糖蛋白，属受体型酪氨酸激酶，分子量约170 KDa的糖蛋白。整个受体分子可分为三个区域，胞内区也称羧基端区域，含542个氨基酸残基，跨膜区由26个偏疏水氨基酸组成，胞外区也称氨基端区域，含621个氨基酸残基[2-4]。EGF自身或与其他生长因子结合，可以激活EGFR产生许多生物应答，包括细胞增殖、分化和迁移且EGF/EGFR信号在正常发育阶段和创伤愈合等病理生理上的组织修复均有调节作用[5]。EGF可用于治疗烧伤创面及牙周炎[6]，EGF及其受体在成年人多个肿瘤中起抑制作用[7]，在肝再生和创伤修复过程有促进作用，对生殖系统具有调节作用。EGF还可治疗眼科角膜损伤、外伤性皮肤溃疡、口腔溃疡、胃肠道溃疡、神经胶质瘤以及鳞状细胞癌等多种疾病[8]。李克动对家蚕表皮生长因子基因cDNA的克隆及表达特征进行分析[9]。我国柞蚕资源存量丰富，其加工和综合利用水平不断提高，但对于柞蚕表皮生长因子受体(ApEGFR)的研究还比较缺乏。

本研究从NCBI公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得家蚕表皮生长因子受体(BmEGFR)基因序列，我们设计8对针对表皮生长因子受体基因的特异性引物，对该基因进行克隆和生物信息学分析，采用荧光定量PCR方法检测分析柞蚕不同期龄和不同组织中表皮生长因子的基因表达程度。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

供试柞蚕品种为永青，由吉林省蚕业科学研究院保育饲养。取不同龄期的柞蚕样品，分别为1龄柞蚕﹑1眠期柞蚕﹑2龄柞蚕﹑2眠期柞蚕﹑3龄柞蚕﹑3眠期柞蚕﹑4龄柞蚕﹑4眠期柞蚕﹑5龄柞蚕﹑蚕蛹﹑蚕蛾等等。将5龄柞蚕进行解剖，取了组织样品，组织样品分别为柞蚕表皮﹑中肠﹑丝腺﹑脂肪体等。所取的材料均被放入-80 ℃冰箱保存。

TRIzol Reagent购自Ambion公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Promega公司；琼脂糖Agarose购自Invitrogen；MMLV反转录试剂盒、Taq酶﹑dNTP﹑DNAmarker﹑STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer﹑PrimeScriptTMRT reagent Kit(for real time﹑ SYBR®PremixExTaqTMII (TliRNaseH Plus)等购自Takara公司；DEPC购自sigma公司；引物由华大基因科技有限公司合成。

1.2 生物信息学分析

通过NCBI公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得家蚕表皮生长因子受体(BmEGFR)基因序列，采用在线软件primer 3(https://www.yeastgenome.org/primer3)设计引物。采用在线软件SIM(https://web.expasy.org/sim/)对序列进行比对。

1.3 柞蚕总RNA的提取及cDNA合成

各龄期柞蚕和组织样品总RNA的提取按照Trizol试剂盒(Ambion公司产品)说明书分别提取。分别取各组织总RNA 1.0 μg，利用cDNA第一条链合成试剂盒，以Oligo-dT为引物，反转录为cDNA样本。准备试剂过程均在冰上操作。反应体系如下：5X RT buffer 4 μL; Reversetranscriptate 1 μL; dNTPMixture (10mM) 2 μL; 0.1 M DTT 2 μL; OligoDT(0.18μg/μL) 2.5 μL; Protector RNase Inhibitor(40u/μL) 1 μL; Total RNA 1 μg。将上述反应体系混合后，按以下程序进行反应：25 ℃，10 min；55 ℃，30 min； 85 ℃，5 min；冰上终止反应。反应完成后，cDNA 样本-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增

根据已经在线公布的家蚕基因组精细图谱与从NCBI等公共数据库获取的序列信息，我们设计了8对针对表皮生长因子受体基因的特异性引物(表2)。根据BmEGFR基因序列设计的引物，柞蚕的cDNA为模板，进行了PCR，PCR反应体系如下：5X Green GoTaq Flexi buffer10 μL; MgCl2 solution 4 μL; dNTP(10mM) 4 μL; Primer F1/R1 2.5 μL;Taq polymerase 0.5 μL; Template 1 μL；H2O 28 μL。扩增条件:94 ℃ 2 min； 95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 S，72 ℃ 1 min，30循环；72 ℃ 5 min。

1.5 荧光定量PCR检测

根据已获得的家蚕表皮生长因子受体基因部分序列，设计了荧光定量PCR引物(Forward：GTGGTATGGCATACTTGGAAGAG；Reverse：ACCTCCAGCTGCTTTATACTCATC)。内参基因引物( Forward：AAGTCATCACAATCGGGAACG；Reverse：GGAGTTGTAAGTCGCTCGTGG)根据柞蚕的Actin基因设计。荧光定量PCR反应体系：50 μL反应体系中加入25 μL2×HotstartFluo-PCR mix，1 μL primers，0.5 μL probe，1 μL模板，21.5 μL DEPC水，利用荧光定量PCR。荧光定量PCR扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 S；60 ℃ 30 S；40循环。在40个循环反应结束后Ct值将被读取，最后熔解曲线分析随之进行。通过相对定量分析法，分析相关数据，检测其在转录水平上的表达差异。每个样品均有3个重复样，以保证数据的准确性。

3 结果与分析

3.1 各龄期柞蚕总RNA的检测

因未知不同时期柞蚕的表皮生长因子的基因表达程度，取1-5龄柞蚕为样品，提取总RNA，进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，检测其RNA的纯度及浓度(表1)，合成 cDNA。图1可以看出提取的总RNA没有DNA基因组DNA的污染，纯度较高；表1可见所检测的各个龄期总RNA的A260/A280数值都约为2.0左右，所提取到的总RNA浓度较高。

3.2 柞蚕表皮生长因子受体(ApEGFR)的部分基因序列

根据已经在线公布的家蚕基因组精细图谱与从NCBI等公共数据库获取家蚕表皮生长因子受体(BmEGFR)基因序列信息。BmEGFR基因全长为4 350 bp，具有1 449个氨基酸，MW为161.3 kDa，等电点(PI)为5.85。根据BmEGFR基因序列，我们设计了8对针对表皮生长因子受体基因的特异性引物(表2)。BM-EGFR-S1/BM-EGFR-AS1引物是BmEGFR基因两端设计的引物，以柞蚕cDNA为模板PCR扩增中没有出现条带，未获取柞蚕表皮生长因子的全长序列。但这8对引物中BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物在5龄柞蚕cDNA为模板的PCR扩增中出现细微的条带(图2-A)，直接利用这条带PCR产物作为模板，再次进行PCR，在500 bp左右处出现明显的条带(图2-B)。将PCR产物进行基因测序，测序结果与BmEGFR基因做了比对，比对结果ApEGFR的部分基因序列与BmEGFR的2677-3163基因序列有81.7%序列重合(图3)。

M—DNA 分子量标准；1—1龄柞蚕；2—2龄柞蚕；3—3龄柞蚕；4—4龄柞蚕；5—5龄柞蚕

图1 RNA 电泳图

表1 RNA提取纯度及浓度

A.8对引物进行扩增的PCR产物；B.BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物进行第2次PCR扩增产物

图2 柞蚕表皮生长因子受体的部分cDNA的PCR产物

表2 PCR 引物

3.3 不同发育阶段中ApEGFR基因的表达差异

为了研究柞蚕表皮生长因子受体的发生规律，取了不同龄期柞蚕样品(1龄柞蚕﹑2龄柞蚕﹑3龄柞蚕﹑4龄柞蚕﹑5龄柞蚕﹑1眠期﹑2眠期﹑3眠期﹑4眠期﹑蛹﹑蛾等)，分离提取RNA后合成cDNA，进行荧光定量PCR，检测不同发育阶段中 ApEGFR基因的表达差异。结果如图4所示：不同发育阶段的柞蚕中，2龄柞蚕的ApEGFR基因的mRNA 表达量比1龄柞蚕稍微降低，但3龄开始又组逐渐上升，5龄的时候ApEGFR的mRNA 的表达量最高，在蚕蛹和蚕蛾体内的ApEGFR基因的mRNA表达量就明显下降(图4-A)。柞蚕的整个眠期中，2眠期的表达量比1眠期降低，2眠期过后ApEGFR的mRNA 的表达量逐渐上升，到3眠期时ApEGFR基因的mRNA表达量为最高， 4眠期的时候表大量显著降低(图4-B)。同样的方法对5龄柞蚕的表皮﹑丝腺﹑脂肪体﹑中肠等不同组织，进行检测ApEGFR基因的表达程度。结果如图4-C所示，在柞蚕的丝腺中表达量最高，说明ApEGFR基因的表达主要集中在丝腺中，丝腺是该基因的重要的表达场所。中肠表达量次之，但对比丝腺表达量差异大，蚕表皮和脂肪中表达量极少。

4 结 论

柞蚕浑身是宝，其营养丰富，含有多种人体所必须的氨基酸，广泛用于保健食品和医药工业。对柞蚕营养价值的相关报道较多，但关于柞蚕表皮生长因子的研究与报道比较少。本实验设计的8对表皮生长因子受体基因的特异性引物，经PCR扩增后，BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物在5龄柞蚕cDNA为模板的PCR扩增中出现细微的条带，以这条带PCR产物为模板，再次进行PCR，在500 bp左右处出现明显的条带。将PCR产物进行基因测序，测序结果与家蚕表皮生长因子受体(BmEGFR)基因做了比对，比对结果ApEGFR的部分基因序列与BmEGFR的2677-3163基因序列有81.7%序列重合。

同时为了研究柞蚕表皮生长因子受体的发生规律，选取了柞蚕不同的龄期和组织，进行荧光定量PCR，检测不同发育阶段中ApEGFR基因的表达差异。结果表明不同发育阶段和整个眠期的柞蚕中，ApEGFR的mRNA均有表达，但在5龄和3眠期的时候的表达量最高。不同组织中，在柞蚕的丝腺中ApEGFR的mRNA表达量最高，表皮最低。该实验为进一步研究表皮生长因子受体的作用提供了选择依据。