林思琪 陈佳敏 翁诗曼 吴思敏 黄耿昌 卢超文 朱峰 陈忻 曾飞

摘要：【目的】优化苯酚—硫酸法液化松木层孔菌的工艺参数，分析液化前后松木层孔菌化学官能团变化，揭示其液化机理，为废弃松木层孔菌的高效利用开辟一条新途径。【方法】以松木层孔菌为原料、浓硫酸为催化剂、苯酚为液化剂，考察料液比（原料/苯酚）、液化温度、液化时间和催化剂用量对松木层孔菌液化率的影响，并通过红外光谱对松木层孔菌原料和液化残渣进行分析。【结果】4个因素对松木层孔菌液化率影响排序为料液比>液化时间>催化剂用量>液化温度，优化的液化工艺参数为：料液比1∶6、液化温度170 ℃、液化时间75 min、催化剂用量0.30 g，在此条件下，松木层孔菌液化率为48.64%。液化前后松木层孔菌红外光谱特征峰的形状和吸收位置均发生明显变化，3366 cm-1的活泼氢吸收峰在液化后发生红移，酰胺羰基吸收峰则分别由1697和1657 cm-1移至1701 cm-1，由1554 cm-1移至1612和1512 cm-1。【结论】采用苯酚—硫酸法可有效液化松木层孔菌，松木层孔菌含氮主要成分几丁质发生脱乙酰化反应，液化产物含有大量酚类物质，可进一步用于制备高附加值化工产品，为高等真菌菌渣的综合利用开辟新途径。

关键词： 松木层孔菌;几丁质;苯酚—硫酸法;液化;红外光谱

0 引言

【研究意义】将木材、秸秆等生物质资源有效液化得到化工原料和生物燃油，是减少环境污染和缓解化石能源危机的一种重要生物质资源利用手段（Jiang et al.，2018;Kim et al.，2019;Zhao et al.，2019）。常見的液化剂有苯酚、多元醇和环状碳酸酯，其中苯酚—硫酸法由于液化条件温和，液化效果较好，已被广泛应用于玉米秸秆、木薯秆等多种生物质资源的液化（莫引优等，2013;唐贤明等，2014）。在长期对食药用菌资源的研究开发过程中，本课题组发现，来自蘑菇种植业和制药业等产业的食药用菌菌渣利用率极低，除了部分进行堆肥还田处理或作为动物饲料外，大多数菌渣被随意丢弃，造成严重的环境污染（岑婉莹等，2016;卢卫红等，2017;朱峰等，2017）。因此，迫切需要开发新的技术对这些废弃菌渣资源进行高效利用。【前人研究进展】几丁质是大多数真菌细胞壁的主要成分（邢来君和李明春，1999），也是虾壳、蟹壳等的主要成分，已有学者研究几丁质在不同条件下的液化情况。Pierson等（2014）报道，在硫酸催化下，几丁质在160 ℃乙二醇中液化90 min后，75%被液化，生成的主要产物是羟基乙基-2-氨基-2-脱氧吡喃糖苷和羟基乙基-2-乙酰氨基-2-脱氧吡喃糖苷;Zhang和Yan（2016）利用蚁酸在100 ℃下液化几丁质12 h，液化率可达60%;经长时间液化后，液化产物可转化为5-甲酰氧基甲基糠醛，产率35%。为扩大渔业废弃资源的应用范围，Zhang等（2018）将球磨几丁质在聚乙二醇400/甘油混合溶剂中液化成多元醇，并进一步与聚乙烯醇共混制备得到抗菌活性显著改善的共混膜;Zheng等（2018）则以硫酸为催化剂，将球磨几丁质在160 ℃的二乙二醇中液化120 min，液化产物进一步与聚乙烯醇混合制备得到共混膜，并将其应用于废虾壳的液化。目前将液化技术应用于高等真菌的研究较少。Jasiunas等（2017）研究发现，将废蘑菇培养土与山杨木混合进行酸浸共液化，可降低残渣率，但单独将废蘑菇培养土浸泡液化则无效;Durak（2018）通过超临界热解技术将云芝转化为生物油、生物炭和气体产物，研究发现催化剂和温度对云芝的超临界热解产物具有重要影响。【本研究切入点】担子菌松木层孔菌[Phellinus pini（Thore：Fr.） Ames]是木层孔菌属高等真菌，具有抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性（Zhu et al.，2017），但目前尚未见有关松木层孔菌菌渣利用的研究报道。【拟解决的关键问题】将苯酚—硫酸法应用于松木层孔菌的液化，研究料液比（原材料/苯酚）、液化温度、液化时间和催化剂用量对液化率的影响，并通过红外光谱对液化残渣进行分析，旨在为废弃松木层孔菌的高效利用开辟一条新途径。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

松木层孔菌采自广东省佛山市南海区岗山，风干后粉碎过40目筛，105 ℃烘干至恒重备用（未经提取利用的松木层孔菌粉末）。苯酚、浓硫酸和甲醇均为市售分析纯试剂。主要仪器设备：DF-101S恒温磁力搅拌器（上海力辰仪器科技有限公司）、IR Tracer-100傅里叶红外光谱仪（日本岛津公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 松木层孔菌成分分析 根据国家标准GB/T 35818—2018测定松木层孔菌抽提物、灰分和木质素含量。采用重铬酸钾氧化法（唐国涛等，2012）测定样品中纤维素含量。

1. 2. 2 松木层孔菌液化 准确称取一定量松木层孔菌粉末加入标口锥形瓶中，然后加入一定量苯酚和浓硫酸，放入搅拌子，置于已预热至预设温度的油浴锅中，套上球形冷凝管，接通循环冷凝水，开动搅拌，液化反应一定时间后，立即用已干燥至恒重的G2滤器抽滤，甲醇充分洗涤残渣至滤液无色为止。G2滤器和残渣一并放入105 ℃烘箱烘干至恒重，计算液化率。

液化率=（松木层孔菌质量-残渣质量）/松木层

孔菌质量×100

1. 2. 3 单因素试验

1. 2. 3. 1 液化温度选择 固定料液比1∶5（松木层孔菌粉末4.00 g，苯酚20.00 g）、催化剂（浓硫酸）用量0.20 g、液化时间60 min，分别在液化温度为130、140、150、160和170 ℃的条件下对松木层孔菌粉末进行液化。

1. 2. 3. 2 催化剂用量选择 固定料液比1∶4（松木层孔菌粉末4.00 g，苯酚16.00 g）、液化时间60 min、液化温度150 ℃，分别在催化剂用量为0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 g的条件下对松木层孔菌粉末进行液化。

1. 2. 3. 3 料液比选择 固定松木层孔菌粉末用量4.00 g、液化时间60 min、液化温度150 ℃、催化剂用量0.20 g，液化剂苯酚用量分别为16.00、20.00、24.00、28.00和32.00 g，即在料液比分别为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8的条件下对松木层孔菌粉末进行液化。

1. 2. 3. 4 液化时间选择 固定料液比1∶4（松木层孔菌粉末4.00 g，苯酚16.00 g），催化剂用量0.20 g，液化温度150 ℃，分别在液化时间为30、45、60、75和90 min的条件下对松木层孔菌粉末进行液化。

1. 2. 4 正交试验设计 在单因素试验基础上，设计4因素（料液比、液化温度、液化时间和催化剂用量）3水平正交试验，优化松木层孔菌液化工艺条件。正交试验因素及水平见表1。

1. 2. 5 松木层孔菌及其液化残渣的红外光谱分析

采用红外光谱仪对松木层孔菌粉末和液化残渣进行分析，溴化钾压片，扫描范围4000～450 cm-1。

1. 3 统计分析

采用OriginPro 9.1进行方差分析和多重比较，使用Excel 2013制图。

2 结果与分析

2. 1 松木层孔菌成分分析结果

成分分析结果表明，松木层孔菌的木质素含量高达46.03%，纤维素含量为15.36%，灰分含量为5.64%，抽提物（脂溶性物质）含量为6.84%。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 液化温度对松木层孔菌液化率的影响 从图1可看出，随着液化温度升高，松木层孔菌液化残渣越少;液化温度升至160 ℃时，液化率达峰值（47.69%）;之后，隨着液化温度继续升高，液化率反而降低。其原因可能是随着液化温度升高，松木层孔菌的主要成分木质素、纤维素、葡聚糖和几丁质等大分子化合物开始迅速分解，液化效果明显，但升至160 ℃高温后，由于液化体系中产生大量的自由基，自由基与自由基之间、自由基与底物之间又发生缩聚反应产生新的高分子重新聚集，使得液化率降低，残渣增加。因此，液化温度选择160 ℃为宜。

2. 2. 2 催化剂用量对松木层孔菌液化率的影响

从图2可看出，随着催化剂浓硫酸用量增加，松木层孔菌液化率迅速上升，当催化剂用量为0.30 g时，液化率达最大值（42.54%）;之后继续增加催化剂用量，液化率反而下降。其原因可能是随着催化剂用量增加，加速了松木层孔菌中大分子的分解反应，但催化剂用量超过0.30 g，过多的浓硫酸使反应体系产生大量的碳正离子活泼中间体，碳正离子进一步进攻底物发生聚合反应，产生新的大分子重新聚集，导致残渣质量增加，液化率反而下降。因此，选择催化剂用量0.30 g为宜。

2. 2. 3 料液比对松木层孔菌液化率的影响 从图3可看出，当料液比由1∶4降至1∶5后，松木层孔菌液化率迅速上升到39.68%;随着液化剂苯酚用量继续增加，料液比达1∶5后，液化率继续上升，但上升趋势变缓。原因是液化剂苯酚用量的增加可促使松木层孔菌中大分子的分解反应向正方向进行，同时，过量的液化剂起着溶剂化作用，可部分阻止分解反应产生的自由基、碳正离子等活泼中间体进一步与底物发生聚合反应;但当料液比达1∶5后，松木层孔菌大分子的分解反应趋于平衡，因此，继续增加液化剂苯酚用量，液化率上升不明显。因此，为了节省成本，选择料液比1∶5为宜。

2. 2. 4 液化时间对松木层孔菌液化率的影响 从图4可看出，随着液化时间的延长，松木层孔菌液化率逐渐上升，但液化60 min后，液化率上升趋势有所减缓。总体来说，延长液化时间，有利于松木层孔菌的液化。

2. 3 松木层孔菌液化正交试验结果

由表2可知，4个因素对松木层孔菌液化率影响依次为料液比>液化时间>催化剂用量>液化温度。浓硫酸催化苯酚液化松木层孔菌的最优参数组合为A3B3C3D2，即料液比1∶6、液化温度170 ℃、液化时间75 min、催化剂用量0.30 g，在此工艺条件下进行验证，得到松木层孔菌液化率为48.64%。

2. 4 松木层孔菌液化前后红外光谱分析结果

通过红外光谱仪对采用优化工艺液化松木层孔菌后的残渣和液化前松木层孔菌粉末进行分析，得到红外光谱图（图5）。从图5可看出，与液化前的红外光谱图相比，松木层孔菌液化残渣的红外光谱发生明显变化。液化前松木层孔菌红外光谱中3366 cm-1的活泼氢（O-H键和N-H键）伸缩振动吸收峰在液化后发生红移，明显变宽，并且覆盖了样品中饱和C-H键的伸缩振动吸收峰（2924 cm-1），提示液化残渣中大分子的活泼氢有相当一部分是以缔合形式存在。液化前，松木层孔菌1697和1657 cm-1处是酰胺Ⅰ带特征吸收峰;液化残渣的羰基特征峰则出现在1701 cm-1，提示液化残渣中可能存在解聚后重新聚合生成的醛酮类聚合物，也可能是多糖降解产物5-羟基糠醛自身聚合或与苯酚反应形成的一种高分子化合物。液化前酰胺Ⅱ带特征峰1554 cm-1在液化后的残渣中出现在1612和1512 cm-1。羟基和氨基红移现象及酰胺Ⅰ带和Ⅱ带蓝移现象，有可能是因为松木层孔菌中大分子解聚后生成的分子重新聚合并通过氢键缔合在一起所导致。液化前松木层孔菌β-葡聚糖的振动吸收特征峰1041 cm-1，在液化残渣中则出现在1171、1109和1036 cm-1;在多糖C-O键和C-O-C键为主的指纹特征区（900～450 cm-1），液化前后变化也非常明显。

3 讨论

据报道，灵芝多孔菌含有高达70%以上的纤维素和木质素（王松华等，2013），而本研究的成分分析结果表明松木层孔菌中木质素含量为46.03%，纤维素含量为15.36%，灰分含量为5.64%，抽提物（脂溶性物质）含量为6.84%。可见不同菌种的化学组成虽然不同，但纤维素和木质素含量均很高。担子菌松木层孔菌是一种木腐真菌，通过分泌酶将纤维素和木质素降解为自身细胞壁主要成分葡聚糖（α和β-1，3）、几丁质、甘露聚糖和蛋白质等大分子（李明月等，2012）。因此松木层孔菌的液化，除了需要将主要成分纤维素和木质素液化之外，还需要液化葡聚糖、几丁质、甘露聚糖和蛋白质等大分子。几丁质又称甲壳素，是以β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖为单元的无支链多糖，对几丁质液化的研究表明，几丁质在液化时首先会发生脱乙酰化（Pierson et al.，2014）。动力学研究表明几丁质的酸催化液化为复杂的多级反应（张洁等，2017）。许文茸等（2018）在对几丁质液化研究的基础上，综述了几丁质在不同液化剂中的液化机理，表明用不同液化剂对几丁质进行液化，其液化产物不同，液化机理也不尽相同。

本研究以浓硫酸为催化剂、苯酚为液化剂，在一定液化温度下液化一定时间，可将松木层孔菌进行液化。从单因素试验结果可看出，料液比、液化温度、液化时间和催化剂用量等因素对松木层孔菌液化率的影响均较大，尤其延长液化时间和增加液化剂用量可提高松木层孔菌液化率，但当料液比达1∶5和液化60 min后，液化率上升趋势变缓。正交试验结果显示，料液比对松木层孔菌液化率的影响最大，其次为液化时间，催化剂用量和液化温度的影响相对较小，优化得到的液化工艺参数为料液比1∶6、液化温度170 ℃、液化时间75 min和催化剂用量0.30 g，但在该工艺条件下，松木层孔菌总体液化率不高，未能超过50%，液化效果相当于张洁等（2017）以浓硫酸催化乙二醇液化几丁质的液化效果（残渣率51.7%）。不同于张洁等（2017）以纯几丁质为液化材料，本研究的液化材料为含有高含量几丁质的松木层孔菌子实体。分析液化率不高的原因：一方面可能是由于松木层孔菌细胞壁主要成分是葡聚糖、几丁质和甘露聚糖等难以被液化的多糖;另一方面可能是松木层孔菌主要成分被液化后重新聚合生成较多的沉淀产物。

分析松木层孔菌液化前后红外光谱图可知，松木层孔菌液化残渣中羟基、氨基和酰胺羰基等官能团特征峰的形状和位置均发生了显著变化，说明松木层孔菌中的葡聚糖、几丁质和甘露聚糖等多糖在液化时发生解聚反应生成新产物。结合许文茸等（2018）总结的几丁质液化机理，可证明松木层孔菌含氮主要成分几丁质发生了脱乙酰化反应。由于液化残渣是由多种物质组成的混合物，红外光谱分析只能判断出该混合样品中特征官能团是否发生变化，无法分析出具體化学成分组成，因此，只能初步揭示松木层孔菌液化机理。苯酚—硫酸法常压催化液化纤维素首先发生纤维素的降解生成葡萄糖和5-羟甲基糠醛，再进一步与液化剂苯酚反应生成各种小分子产品。几丁质的降解机理与纤维素相似，1，4-糖苷键断裂生成单糖苷，但不同的是几丁质含有的乙酰氨基进一步脱乙酰化得到氨基葡萄糖，再转化生成各种小分子。下一步需对松木层孔菌液化残渣和离子液体化学成分进行分析，通过气相色谱—质谱联用、液相色谱—质谱联用和核磁共振波谱等技术对液化产物进行分析，鉴定液化产物分子结构，以进一步揭示松木层孔菌的液化机理。

此外，由于松木层孔菌含有大量木质素，木质素降解后得到许多酚类小分子，同时用苯酚为液化剂，液化产物会有过量的苯酚存在，因此，可利用酚类化合物的特点，将液化产物进行酚醛缩合反应制备得到各种酚醛树脂、环氧树脂等化工产品，拓展液化产物的高值化利用，也可为高等真菌菌渣的综合利用开辟一条新途径。

4 结论

采用苯酚—硫酸法可有效液化松木层孔菌，且延长液化时间和增加液化剂用量均有利于液化反应。在催化剂浓硫酸和液化剂苯酚共同作用下，松木层孔菌含氮主要成分几丁质发生脱乙酰化反应，液化产物含有大量酚类物质，可进一步与甲醛缩合制备成酚醛树脂或与环氧乙烷缩合制备成环氧树脂，具有较高推广应用价值。

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（责任编辑 罗 丽）