田 莹，檀 军,2，赵 帅，郭建军*

(1.贵州大学昆虫研究所，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025；2.遵义医科大学，组织学与胚胎学教研室，贵州遵义 563000)

癌症已经成为严重威胁人类生命健康的头号杀手，且发病率和死亡率急剧上升(毛艳艳等，2016)。《2018年全球癌症报告》显示，乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，新增发病人数约210万人，发病率和死亡率分别占女性癌症患者的24.2%和15%，高居首位(Brayetal.,2018)。乳腺癌的防控与治疗形势严峻。

昆虫类中药在治疗肿瘤中发挥重要的作用(林璐璐等，2009)，九香虫Aspongopuschinensis(Dallas,1851)即是其中一种(张笠等，2011)。九香虫始载于《本草纲目》，具有温中助阳、理气止痛的功效，是具有较高药食两用价值的昆虫(蔡仁莲等，2016)。现代医学证明其可用于治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌等(徐波等，2007；范钦等，2011；檀军等，2013；杨佳琪等，2017；Tanetal.,2019)，也有抗菌和抗氧化等功效(中华本草编委会，1999；高颖晖等，2015)。

研究表明，九香虫血淋巴具有抑制乳腺癌和胃癌细胞增殖的作用(檀军等，2013；杨佳琪等，2017)，但九香虫血淋巴提取工艺较复杂，稳定性较差。九香虫在临床上的用药形式主要为水煎液(刘庆芳，2002)，其制备工艺简单，经过高温煎煮，药物稳定性较高，通过煎煮的方式可使药物活性成分充分释放和溶解于汤剂中。然而，高温煎煮又可导致部分蛋白变性、物质降解等，影响药效，哪些物质可能发挥主要的抗癌功效等仍然未知。因而本研究通过高温煎煮九香虫粉末，制备九香虫水煎液，检测其对乳腺癌细胞体外增殖的影响，分析九香虫水煎液主要成分，并讨论分析其主要成分与其主要功效之间的关系，为九香虫深层次开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

九香虫(购自贵州省凯里市，置于恒温干燥箱烘干备用)，人乳腺癌细胞系MDA-MB-453及小鼠乳腺癌细胞系4T1购自中科院上海细胞库。

1.2 主要试剂耗材

L-15培养基(武汉博士德生物工程有限公司)，RPMI-1640培养基(美国赛默飞公司)，胎牛血清(杭州四季青)，甲醇(德国CNW Technologies公司)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技公司)，0.22 μm针管式过滤器(美国密理博公司)，色谱柱(美国安捷伦公司)。

1.3 实验仪器

202型电热恒温干燥箱(北京永光明医疗仪器厂)，超低温冰箱(美国赛默飞公司)，Heraeus Fresco17离心机(美国赛默飞公司)，倒置相差显微镜(厦门麦克奥迪有限公司)，7890A气相色谱仪(美国安捷伦公司)，PEGASUS HT质谱仪(美国力可公司)，PS-60AL超声仪(深圳雷德邦电子有限公司)，LNG-T98真空干燥仪(太仓华美生化仪器厂)，酶联免疫检测仪(美国赛默飞公司)。

1.4 实验方法

1.4.1样品制备

九香虫活虫以纯水清洗两遍，滤纸吸干虫体表面水分，置于电热恒温干燥箱中80℃烘烤4 h后研磨成粉末，称取20 g虫粉，加入80 mL纯水，室温浸泡30 min后于砂锅中煎煮40 min，最后小火浓缩成浓度为0.5 g/mL的九香虫水煎液。将九香虫水煎液以6 000× g离心10 min，吸取上清液并用0.22 μm滤头过滤除菌，-20℃保存备用。

取200 μL九香虫水煎液于1.5 mL离心管中，加入800 μL甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸(1 mg/mL溶于纯水中)作为内标，涡旋30 s。于-20℃条件静置10 min，冰水浴条件下超声5 min，以12 000× g离心15 min，小心吸取上清液 400 μL，在真空干燥仪中干燥。向干燥后的物质加入甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg/mL)，轻轻混匀后，放入烘箱中80℃孵育30 min。向每个样品中加入BSTFA(含有1%TMCS，v/v)，将混合物70℃孵育1.5 h，随机上机检测。

1.4.2人乳腺癌细胞MDA-MB-453细胞及小鼠乳腺癌细胞4T1培养

人乳腺癌MDA-MB-453使用含10%胎牛血清(FBS)，1%青链霉素混合液的L-15培养基，置于37℃，空气相培养箱中培养。小鼠乳腺癌4T1细胞使用含10%FBS，1%青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4.3形态学观察法及MTT法检测九香虫水煎液对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

使用0.25%胰酶消化处于对数生长期的MDA-MB-453、4T1细胞，用细胞计数仪测定细胞密度，调整细胞密度为1×105个/mL，分别接种于96孔培养板中，每孔100 μL。实验设置实验组、对照组(无药物组)及空白组(无细胞组)。用对应培养基将九香虫水煎液稀释成生药浓度梯度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，并用0.22 μm滤头过滤除菌。24 h后，弃旧培养液，加入上述浓度梯度的水煎液，每个浓度设5个重复。水煎液作用24 h后，利用倒置相差显微镜拍摄细胞形态图。48 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，继续放入细胞培养箱培养4 h后，吸去上清液，每孔加200 μL二甲基亚砜(DMSO)，置于恒温摇床37℃震荡10 min以彻底溶解紫色结晶。使用酶标仪在570 nm波长条件检测吸光度(OD)值。每组实验重复3次。计算细胞增殖率，增殖率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100，并用SPSS 17.0分别计算九香虫水煎液对两种细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.4.4细胞划痕法观察九香虫水煎液对小鼠乳腺癌细胞4T1细胞迁移的影响

取对数生长期的4T1细胞消化并接种于24孔板(细胞密度为4×104个/孔)，置于培养箱中培养。待细胞生长90%融合时，用200 μL吸头沿每个孔的中轴划痕，划痕后用无菌PBS洗涤3次。用RPMI-1640培养液稀释九香虫水煎液，加入水煎液浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，每个浓度3个复孔。分别在0 h和24 h用倒置相差显微镜拍照，观察各组细胞迁移情况，每组实验重复3次。采用Image J及SPSS 17.0软件对实验结果进行统计分析。细胞迁移率(%)=(0 h 划痕宽度-24 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100。

1.4.5GC-MS测定九香虫水煎液主要成分

气相色谱条件：采用DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为高纯度氦气，前进样口流速3 mL/min；柱流速为1 mL/min；进样量为1 μL。初始温度50℃，持续1 min，然后以10℃/min的速率上升到310℃，保持8 min；质谱条件：前进样口、传输线和离子源温度是分别是280、280和250℃；离子源为EI；电子能量70 eV；质谱数据在全扫描模式下获得，质量扫描范围m/z为50～500。

1.5 数据处理

实验数据应用统计软件SPSS 17.0进行单因素方差分析，所有数据使用x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水煎液对乳腺癌细胞增殖抑制的作用

不同浓度九香虫水煎液作用于乳腺癌MDA-MB-453细胞24 h后，通过细胞形态观察和MTT实验检测九香虫水煎液对MDA-MB-453细胞增殖的抑制作用。MDA-MB-453细胞形态图(图1)显示，0.04～0.10 g/mL浓度组细胞皱缩，体积变小，细胞贴壁能力降低，漂浮细胞较多，对照组和0.02 g/mL浓度组细胞呈饱满的圆形，贴壁细胞数量较多，细胞轮廓清晰。

图1 九香虫水煎液作用24 h对MDA-MB-453细胞形态的影响Fig.1 Effects of Aspongopus chinensis decoction on the morphology of MDA-MB-453 cells for 24 h注：A-F分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL，200×。Note:A to F reflects 0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 g/mL,200×.

MTT检测结果显示，九香虫水煎液可显著抑制MDA-MB-453及4T1细胞的生长(P<0.05)。结果表明九香虫水煎液具有抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-453、小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的作用，且呈浓度依赖性，九香虫水煎液作用于MDA-MB-453、4T1细胞的IC50浓度分别为0.034、0.101 g/mL。

图2 九香虫水煎液作用48 h对MDA-MB-453细胞增殖的影响(P<0.05)Fig.2 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of MDA-MB-453 cells for 48 h(P <0.05)

2.2 九香虫水煎液对4T1细胞迁移的影响

4T1划痕实验结果显示，对照组4T1细胞迁移率为42.67%±0.88%，浓度为0.02、0.04 g/mL水煎液作用于4T1细胞24 h后迁移率分别为18.33%±4.91%和8.67%±2.85%，加样浓度为0.06、0.08、0.10 g/mL水煎液作用于4T1细胞24 h后大量细胞漂浮，呈弥散状，无法测得迁移率。对照组迁移距离显著大于实验组(P<0.05)，表明九香虫水煎液可显著抑制4T1细胞的迁移能力。

图3 九香虫水煎液作用48 h对4T1细胞增殖的影响(P <0.05)Fig.3 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of 4T1 cells for 48 h(P <0.05)

图4 九香虫水煎液作用0 h和24 h对4T1细胞迁移影响的形态图(40×)Fig.4 Morphological diagram of Aspongopus chinensis decoction on migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (40×)

图5 九香虫水煎液作用24 h对4T1细胞迁移的影响(P<0.05)Fig.5 Effect of the Aspongopus chinensis decoction on the migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (P<0.05)

2.3 GC-MS测定九香虫水煎液主要成分

使用ChromaTOF软件对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分等分析(Kindetal.,2009)。根据离子流色谱图(图6)，使用PubChem和KEGG数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配，对物质进行定性分析，共分析得出455种物质。根据峰面积归一化法得出各成分相对含量。根据数据库匹配相似性≥800，筛选相对含量较高的20种化合物(表1)。其中，3,4-二羟基苯甲酸(0.88%)、尿苷(0.77%)、反丁烯二酸(0.72%)、腺苷(0.61%)、棕榈酸(0.61%)等物质可能与其能够抑制乳腺癌细胞增殖有关。

表1 九香虫水煎液主要化合物成分Table 1 Main compound components of Aspongopus chinensis decoction

图6 九香虫水煎液总离子流量(TIC)图Fig.6 Total ion flow diagram of Aspongopus chinensis decoction

3 结论与讨论

3.1 九香虫水煎液含有抗菌、抗氧化、镇痛、助阳等活性成分

九香虫水煎液GC-MS分析结果显示，其中含量较多的物质有反丁烯二酸、鸟氨酸、腐胺、瓜氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、尿苷、腺苷、棕榈酸等。反丁烯二酸具有镇痛及抗菌的作用(吴素香等，2012；董瑷榕等，2019)，鸟氨酸与瓜氨酸在体内可转化为精氨酸，精氨酸、腐胺具有提高精子活性的作用(Moralesetal.,2003)，这几种物质的作用与《本草纲目》所记载的九香虫“理气止痛，温中助阳”之功效相符。3,4-二羟基苯甲酸广泛存在于天然药物中，具有抗菌、抗氧化、抗炎症和抗肿瘤的作用(Yinetal.,2009;Gutiérrez-Larraínzaretal.,2012;Palafox-Carlosetal.,2012;Deletal.,2014)，其抗菌和抗氧化的作用与中华本草编委会(1999)和高颖晖等(2015)结论一致。

3.2 九香虫水煎液可抑制乳腺癌细胞体外增殖

本实验研究结果显示，九香虫水煎液对乳腺癌细胞体外增殖与迁移具有显著的抑制作用(如图1～图5)，结合GC-MS分析结果，在九香虫水煎液中检测到了反丁烯二酸、3,4-二羟基苯甲酸、腺苷、尿苷、棕榈酸(如表1)。反丁烯二酸、3,4-二羟基苯甲酸具有抗肿瘤作用(Yinetal.,2009;吴素香等，2012)，腺苷是抗肿瘤核苷类的前体(刘洋等，2012)，尿苷可以调节乳腺癌细胞的分化、增殖与凋亡(Mujoomdaretal.,2004)；棕榈酸可抑制肝癌细胞增殖与促进其凋亡(Nagataetal.,2015)。上述物质均可能与九香虫水煎液能够抑制乳腺癌细胞增殖有关。

九香虫经过高温煎煮仍然具有抑制乳腺癌细胞增殖的活性，通过GC-MS检测，九香虫水煎液主要成分中具有抗癌活性的成分较多，便于探究其药理药效和筛选抗癌活性成分。但九香虫水煎液中具体是何种物质起主要的抗肿瘤作用及其抗肿瘤的机制尚需进一步实验研究。本研究采用的4T1细胞系有很强的远处转移能力，可用于构建乳腺移植瘤动物模型，该模型的细胞生长和远处转移与人类乳腺癌IV期十分相似，已被成功运用到了恶性肿瘤治疗药物的研究中(Yangetal.,2012)，九香虫水煎液可显著抑制该细胞的增殖与迁移，可为后期探究九香虫水煎液对小鼠乳腺癌的体内抑制作用提供参考。