常振策，李忠旬，贾利娜，修江帆，国果,2，吴建伟,2***

(1.贵州医科大学 贵州省普通高等学校现代病原生物学特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 寄生虫学教研室，贵州 贵阳 550025)

家蝇生活在病原物富集的环境中，却鲜见感染造成的伤害，并且能够正常地完成生命活动，说明它具有强大的先天性免疫系统[1-4]。近年来，家蝇的先天免疫日益成为研究热点。课题组前期研究发现，白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后可刺激家蝇C型凝集素基因(C-type lectin gene ofMuscadomestica，Mdctl)表达上调，认为该基因的表达产物在家蝇抗C.albicans感染过程中起作用[5]，但目前尚未见有关Mdctl基因的研究报道。为后续研究Mdctl基因在家蝇幼虫抗C.albicans感染过程中的作用，本课题研究构建家蝇Mdctl基因原核表达体系，获得了纯化的Mdctl基因表达产物，并进行了生物信息学分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物、质粒和菌株 家蝇3龄幼虫为本课题组饲养，克隆感受态E.coliDH5α和表达感受态E.coliBL21(DE3，北京全式金)，克隆载体pMD19-T购自Takara公司，表达载体pET-28a(+)购自Solarbio公司。

1.1.2主要试剂及仪器 Trizol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、原核表达相关试剂、氨苄青霉素购自Takara，SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂、卡那霉素、羊抗小鼠IgG-HRP、Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody、Western-Blot相关试剂及耗材购自Solarbio，Ni-IDA Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自碧云天公司。核酸凝胶电泳装置及成像系统、超声破碎仪、电转移装置、蛋白凝胶电泳装置均在贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室使用，Bio-Rad ChemiDoc MP和Nanodrop2000在贵州医科大学基础医学科研中心使用。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析 运用DNAMAN V6.0软件分析Mdctl基因的开放阅读框、氨基酸序列和Mdctl蛋白信号肽位点，利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析Mdctl蛋白的理化性质、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析Mdctl蛋白功能结构域。

1.2.2pMD19-T/Mdctl克隆载体和pET28a(+)/Mdctl表达载体的构建 按照Trizol说明书提取家蝇三龄幼虫总RNA，然后以总RNA为模板，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit逆转录合成cDNA作为Mdctl基因克隆时PCR扩增的模板。基因组DNA的除去反应条件为42 ℃ 2 min，然后冰浴5 min。逆转录反应条件为37 ℃ 20 min，85 ℃ 10 s，4 ℃ 10 s。利用Primer 5.0设计Mdctl基因的克隆引物(CkF、CkR)和Mdctl基因的表达引物(CbF、CbR)，由上海生工合成。Mdctl基因克隆上游引物(CkF)为ATGGGCGGTTACTTGGCCTC、游引物(CkR)为TCAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTCGGGC；Mdctl基因表达上游引物(CbF)为CTAGCTAGCGACTATTATCCAACTGACAGATGGTG，下游引物(CbR)为CCCAAGCTTTCAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTC。Mdctl基因PCR扩增的反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃最后延伸10 min。PCR产物用DNA凝胶试剂盒纯化回收，纯化PCR产物和pMD19-T载体连接条件为16 ℃环境下作用12～16 h。将pMD19-T/Mdctl转化至E.coliDH5α克隆感受态细胞中，LB平板(含氨苄青霉素100 mg/L)筛选阳性转化子，转接液体培养后提取重组质粒进行测序鉴定。以测序成功的pMD19-T/Mdctl克隆质粒为模板，扩增Mdctl基因。Mdctl基因和pET-28a(+)载体双酶切反应条件为37 ℃水浴酶切16～18 h,酶切产物用DNA凝胶试剂盒纯化回收。酶切纯化后Mdctl基因和pET-28a(+)载体连接条件为16 ℃环境下作用16～18 h。将pET28a(+)/Mdctl转化至E.coliDH5α感受态细胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)筛选阳性转化子，转接液体培养后提取重组质粒进行测序鉴定。

1.2.3重组蛋白诱导表达、纯化与鉴定 将测序鉴定的pET-28a(+)/Mdctl重组质粒转化至E.coliBL21/DE3感受态细胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)筛选阳性转化子，进行测序鉴定，鉴定正确的单菌落再次接种于LB液体培养基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振摇培养12 h后，以1 ∶50接种于新鲜LB液体培养基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振摇培养至OD600值为0.6时，分别以不同浓度的IPTG、温度和培养时间进行诱导表达。在离心重悬浓缩后的培养物中加入5×SDS上样缓冲液，瞬时离心后煮沸10 min，15%的SDS-PAGE凝胶电泳分析Mdctl蛋白的表达，确定重组蛋白的最佳诱导条件。超声破碎诱导表达的菌体，分别取上清和沉淀进行15%SDS-PAGE凝胶电泳。按照蛋白纯化试剂盒说明书，纯化Mdctl重组蛋白，Western Blot鉴定Mdctl纯化蛋白。

2 结果

2.1 生物信息学分析

Mdctl基因ORF长为333 bp，编码110个氨基酸(图1)。Mdctl蛋白的信号肽为1～22位氨基酸，判定其为分泌型蛋白(图2)。Mdctl蛋白理论分子量为13 131.42 Da，等电点约为4.49。Mdctl蛋白的Clect结构域为23～110位氨基酸，属于C型凝集素超家族(图3)。

注：图中方框内为信号肽序列。图1 Mdctl基因的开放阅读框及氨基酸序列Fig.1 ORF of Mdctl and its amino acid sequence

图2 Mdctl蛋白的信号肽分析Fig.2 Signal Peptide analysis of Mdctl protein

图3 Mdctl蛋白的功能结构域分析Fig.3 Conserved domain analysis of Mdctl protein

2.2 pMD19-T/Mdctl克隆载体和pET28a(+)/Mdctl表达载体的构建

家蝇三龄幼虫总RNA电泳检测可见，18 S条带较28S条带明亮清晰，28S条带暗淡模糊，说明提取的总RNA无显著降解(图4)。用Mdctl基因的克隆引物(CkF和CkR)对pMD19-T/Mdctl重组菌进行PCR扩增，电泳检测显示，其PCR产物在333 bp有一特异性条带，与预期的片段大小相一致，经测序鉴定表明Mdctl基因的克隆载体构建成功(图5)。用Mdctl基因的表达引物(CbF和CbR)对pET-28a(+)/Mdctl重组菌进行PCR扩增，电泳显示，其PCR产物条带与理论值完全吻合，经测序鉴定表明Mdctl基因的表达载体构建成功(图6)。

注：M为DNA分子量标准，1为家蝇三龄幼虫总RNA。图4 总RNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA

注：M为DNA分子量标准，1为pMD19-T/Mdctl重组菌落PCR。图5 pMD19-T/Mdctl重组菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pMD19-T/Mdctl

注：M为DNA分子量标准，1为pET-28a(+)/Mdctl重组菌落PCR。图6 pET-28a(+)/Mdctl重组菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pET-28a(+)/Mdctl

2.3 重组蛋白诱导表达、纯化与鉴定

电泳结果显示，在32 ℃，IPTG终浓度为0.6 mmol/L，诱导18 h时的蛋白表达量较高；Mdctl重组蛋白主要存在于沉淀中，为包涵体表达，其分子量约为16 kDa，与Mdctl蛋白两端融合6×His标签后的总分子量相一致(图7)。以小鼠来源的抗His Tag单克隆抗体(1 ∶1 000)为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(1 ∶4 000)为二抗，进行Western blot鉴定Mdctl纯化蛋白，结果显示，Mdctl纯化蛋白与抗His Tag单克隆抗体特异性结合，出现一明显免疫反应条带，分子量(约16 kDa)正确，阴性对照在相应位置未出现该条带，进一步确认其为目的蛋白(图8)。

注：M为14.4～97.4 kDa蛋白Marker，1为pet28a(+)空载未诱导，2为pet28a(+)空载诱导，3为Mdctl重组未诱导，4为Mdctl重组诱导，5为破碎后上清，6为破碎后沉淀，箭头所示为16 kDa目的条带。图7 Mdctl重组蛋白的诱导表达Fig.7 Induced expression of Mdctl recombinant protein

注：M为蛋白分子量标准，1为Mdctl纯化蛋白，2为Mdctl纯化蛋白的His标签单抗检测，3为阴性对照，箭头所示为目的条带。图8 Mdctl纯化蛋白的鉴定Fig.8 Identification of purified Mdctl protein

3 讨论

家蝇具有极强的适应周围恶劣环境的能力，这缘于它强大的先天免疫[1-4]。近年来，家蝇的先天免疫日益成为研究热点。课题组前期研究发现，白假丝酵母菌感染家蝇幼虫后可刺激Mdctl基因表达上调，认为该基因的表达产物在家蝇抗C.albicans感染过程中起作用[5]。生物信息学分析显示，Mdctl基因ORF全长333 bp，编码110个氨基酸，信号肽切割位点为22～23位氨基酸之间，是分泌型蛋白。Mdctl的氨基酸序列中存在Clect(C型凝集素结构)结构域，为23～110位氨基酸，而且还有特异性结合甘露糖的EPN/WND氨基酸基序，因此它属于C型凝集素超家族，是一个新的家蝇C型凝集素。含有Ca2+依赖型的碳水化合物识别结构域(CRD)的为经典C型凝集素，非Ca2+依赖型的C型凝集素结构域(CTLD)的为非经典C型凝集素[6]。C型凝集素在抗感染免疫中的主要功能有：作为一种调理素，参与免疫识别和对病原体的凝集吞噬作用；介导细胞之间的黏附、迁移和细胞之间的相互作用；参与止血、凝固、物质运输及创伤修复等作用；引发凝集素补体途径的激活等[6-8]。为后续研究Mdctl基因表达产物的生物学功能，需要获得足够的Mdctl蛋白，但家蝇体内的Mdctl蛋白含量少、分离提取困难、化学合成代价高，因此重组表达Mdctl蛋白是获取Mdctl基因表达产物的最有效途径。本研究通过构建大肠杆菌原核表达系统[9-13]，诱导表达家蝇Mdctl重组蛋白，分析得出，在32 ℃，IPTG终浓度为0.6 mmol/L，诱导时间18 h时，Mdctl重组蛋白表达量较高。Mdctl重组蛋白主要存在于沉淀中，为包涵体表达。经Western-Blot鉴定，Mdctl纯化蛋白确实为目标蛋白。

鉴于目前家蝇凝集素的分子鉴定[14-17]和家蝇体内的免疫调节功能[18-24]报道甚少，Mdctl作为家蝇体内一种新的凝集素基因，在白假丝酵母菌刺激家蝇三龄幼虫后高表达，本研究将进一步开展它对家蝇先天免疫调节作用的研究。