郭泰麟 李丹丹 张 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116000

柴胡为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狭叶柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的干燥根[1]，习称北柴胡和南柴胡。原名茈胡，又名山菜、地薰、茹草等[2]，始载于《神农本草经》，列为上品。具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气的功效。现代药理研究表明，柴胡具有解热、抗炎、保肝和免疫调节等作用[3-5]。柴胡作为临床常用药物，在解热和保肝方面用量大。但近年来由于北柴胡野生来源逐渐消失，南柴胡的野生资源基本绝种，市面上常见的南、北柴胡的来源均为人工种植。资源匮乏导致柴胡的价格逐渐上涨，市场内偶见使用伪品和正品掺在一起进行销售的现象。市场上常见的伪品有：苍蝇花的根[6]、陆地棉的根、野棉花的根[7]、寻骨风的根[8]。所以柴胡的质量研究逐渐成为热点问题。北柴胡的主产地在山西、陕西、辽宁等省；南柴胡的主产地在陕西、内蒙古、山西、甘肃等地。因此，药材质量的一致性问题也成为临床用药选购的重要依据。现有文献中对于柴胡指纹图谱的建立大多使用VWD或DAD检测器[9-11]，使用ELSD检测器同时建立南、北柴胡指纹图谱的少见报道。基于此类问题，为保证柴胡质量一致性、解决用药混乱的问题，本实验对来自不同产地的24批北柴胡和5批南柴胡及其4种伪品通过HPLC-ELSD法分别建立指纹图谱，鉴定共有指纹峰，分别对不同产地的南北柴胡进行化学成分一致性的评价，旨在对柴胡药材的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)；安捷伦G6240B蒸发光散射检测器(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LFP-800T高速多功能粉碎机；JD200-3千分之一天平(沈阳龙腾电子有限公司)；Sartourius CP225D 十万分之一天平。

1.2 试剂 甲醇、乙醇为色谱纯(Merck KGaA, 62471 Darmstadt, Germancy)，娃哈哈纯净水，对照品柴胡皂苷a(批号：P03M9F50593)购自上海源叶生物科技有限公司，柴胡皂苷d(批号:PS101397)、柴胡皂苷c(批号：PS000193)、柴胡皂苷f(批号：PS000195)均购自成都普斯生物科技股份有限公司。

1.3 药材 实验中所用到24批北柴胡(1-24)、5批南柴胡(25～29)和4批伪品(30～33)收集于全国各地的药材市场，由辽宁中医药大学张慧教授鉴定为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)及狭叶柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的根。具体样品信息见表1和表2。

表1 样品信息

2 方法

2.1 色谱条件 TOSOH TSKgel ODS-100V 色谱柱(4.6mm×150cm，5μm)；乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱：0～15 min: 20%～30% A， 15～20 min: 30%～35% A，20～35 min: 35%～40% A，35～70 min: 40%～70% A，70～80 min: 70%～75% A,80～85 min: 75%～90% A, 85～90 min: 90%～100% A。流速：1 mL/min，柱温：25 ℃，进样量：20 μL。蒸发器温度：30 ℃；雾化器温度：40 ℃；气体流速：1.6 mL/min。

2.2 溶液的制备 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f适量,精密称定，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至容量瓶刻度线。制成柴胡皂苷a 0.401 mg/mL、柴胡皂苷d 0.415 mg/mL、柴胡皂苷c 0.419 mg/mL、柴胡皂苷f 0.451 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品的制备 取本品粉末(过65目筛)0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，向内加入含10%浓氨试液的甲醇液25 mL，密塞，30 ℃水温超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，滤过，使用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液和滤液合并，在60 ℃回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶，使用甲醇定容至容量瓶刻度线，摇匀后过0.45 μm滤，得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性实验 精密称取柴胡8号样品0.5 g，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下方法分别于0、2、4、6、8、12 h间隔进样。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照，计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示，11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于1.03%和2.06%。表明本方法精密度良好。

2.4.2 精密度实验 精密称取柴胡8号样品0.5 g，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下方法，连续测定6次。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照，计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示，11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于1.57%和2.22%，结果说明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验 精密称取6份同样的柴胡8号样品各0.5 g，分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下方法，进样分析。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照，计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示，11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于2.15%和1.53%，说明该方法重复性良好。

3 结果

3.1 指纹图谱的建立 取24批北柴胡和5批南柴胡样品适量， 按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下方法进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 版)分别对24批北柴胡和5批南柴胡样品进行指纹图谱的分析。以陕西宝鸡野生北柴胡(S4)为参照色谱，生成北柴胡的对照指纹图谱(图1)；以山东临沂产南柴胡(S27)为参照，生成南柴胡的对照指纹图谱(图2)。结果在北柴胡的指纹图谱中共得到11个共有峰，南柴胡的指纹图谱上得到14个共有峰。共有峰面积均占指纹图谱峰面积的90%以上，北柴胡指纹图谱详见图3，南柴胡的指纹图谱详见图4。

3.2 指纹峰的鉴定 经查阅文献和与对照品图谱的比对，在南、北柴胡指纹图谱中定出5个成分的结构，分别是柴胡皂苷c(1号峰) ，柴胡皂苷f(2号峰)，柴胡皂苷a(3号峰)，柴胡皂苷e(4号峰)，柴胡皂苷d(5号峰)。

3.3 真伪鉴别 通过将不同产地的南、北的对照指纹图谱及其伪品的指纹图谱(图5)相比较，二者之间具有显著性差异。其中苍蝇花根(S30)、棉花根(S31)和寻骨风根(S32)在色谱图前76分钟中几乎无色谱峰，而野棉花根(S33)的色谱峰跟其余三种伪品差别非常明显。并且四种伪品和正品柴胡的指纹相似度依次为：苍蝇花根(0.0710)、棉花根(0.257)、野棉花根(0.213)、寻骨风根(0.0801)。柴胡及其伪品的指纹图谱差异较大，所以根据HPLC-ELSD方法建立的南、北柴胡指纹图谱可以对柴胡的真伪进行鉴别。

1.柴胡皂苷c 2.柴胡皂苷f 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷e 5.柴胡皂苷d图1 北柴胡的HPLC-ELSD对照图谱

1.柴胡皂苷c 2.柴胡皂苷f 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷e 5.柴胡皂苷d图2 南柴胡的HPLC-ELSD对照图谱

图4 5批南柴胡HPLC-ELSD指纹图谱

图5 伪品HPLC-ELSD色谱图

3.4 柴胡指纹图谱相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 版)对24批北柴胡、5批南柴胡指纹图谱进行处理，以陕西宝鸡野生北柴胡(S4)为参照，计算11个共有峰的保留时间的相似度；以山东临沂产南柴胡(S27)为参照，计算14个共有峰的保留时间的相似度。结果表明，以柴胡皂苷d为参照峰，24批北柴胡、5批南柴胡各个共有峰保留时间RSD为2.51%和3.70%，差异性较小，北柴胡相似度在0.722～0.950之间，南柴胡相似度在0.767～0.927，表明不同产地的南北柴胡均具有一致性,不同产地的北柴胡相似度测定结果见表3，南柴胡相似度见表4。

表3 北柴胡相似度

表4 南柴胡相似度

3.5 主成分分析

3.5.1 北柴胡的主成分的分析 以北柴胡的HPLC-ELSD指纹图谱中的11个共有峰峰面积为变量，使用SPSS 24.0软件进行主成分分析。将特征值及贡献率作为依据，根据载荷量计算综合得分。北柴胡的主成分特征值及贡献率结果见表5。北柴胡中选出了3种主成分，因为这三种主成分对应的特征值大于1。3种主成分的累计贡献率达到了78.3%，说明了这3种主成分可以作为北柴胡质量的评价指标。其中主成分1中系数较大的是X2、X3、X4、X5；主成分2中系数较大的是X7、X9、X11；主成分3中系数较大的是X8；说明3个主成分中的8个共有峰对北柴胡质量评价贡献率较大，表明这8个共有峰对24批北柴胡的质量影响较大。

表5 北柴胡主成分特征值及贡献率结果

3.5.2 南柴胡的主成分分析 以南柴胡的HPLC-ELSD的指纹图谱中的14个共有峰峰面积为变量，根据载荷图计算综合得分。南柴胡的主成分特征值及贡献率结果见表6。南柴胡中选出4种主成分，4种主成份的累计贡献率达到了100%，说明了这4种主成分可以作为南柴胡质量的评价指标。其中主成分1中系数较大的是X1、X2、X5、X6、X7、X10；主成分2中系数较大的是X4；说明2个主成分中的7个共有峰对南柴胡质量评价贡献率较大，表明这7个共有峰对5批北柴胡的质量影响较大。

表6 南柴胡主成分特征值及贡献率结果

4 讨论

本文建立了24批北柴胡、5批南柴胡和4批伪品的HPLC-ELSD指纹图谱，北柴胡提取出11个共有峰，南柴胡提取出14个共有峰。利用中药指纹相似度评价软件南北柴胡进行相似度评价，结果显示，24批北柴胡相似度为0.722～0.950之间;5批南柴胡的相似度为0.767～0.927之间。表明了不同产地的柴胡具有成分的相似性。同时对柴胡的4种伪品进行了真伪鉴别，相似度分别为0.0710、0.257、0.213、0.0801。伪品和正品柴胡的相似度差异性大，这表明建立的指纹图谱可以对柴胡的伪品进行鉴别。

通过SPSS主成分分析的结果得出，影响北柴胡质量的差异性成分有8个，影响南柴胡质量差异性成分有7个。在伪品中并未检测到这些成分，说明通过SPSS得出的质量差异性成分同样可以对南北柴胡的真伪进行鉴别。并且通过对照品的指认和查阅文献，从这些差异性成分中鉴定出了5种成分，X1为柴胡皂苷c，X2为柴胡皂苷f，X3为柴胡皂苷a，X4为柴胡皂苷e，X5为柴胡皂苷d。在南北柴胡中这五种成分都存在。X2、X3、X4、X5这四种成分对北柴胡的质量影响较大，X1、X2、X4、X5这四种成分对南柴胡的质量影响较大。

综上所述，本研究建立的南、北柴胡HPLC-ELSD指纹图谱及主成分分析得出的影响南北柴胡的质量差异性成分，可以为柴胡的质量控制和真伪鉴别提供参考。