熊大维 顾斌涛 刘兰 黄筱萍

摘要 从采摘后贮存自然发病的赣南脐橙中分离出4种病原真菌，根据菌株形态学观察和rDNA-ITS序列分析进行鉴定，这4种病原真菌分别为意大利青霉（Penicillium italicum）、指状青霉（Penicillium digitatum）、柑橘链格孢（Alternaria citri）和芽枝状枝孢（Cladosporium cladosporioides）。生物保鲜剂2-苯乙醇（2-PE）可有效地抑制这4种病原真菌的孢子萌发和菌丝生长，但对不同致腐菌抑菌效果差异显著（P<0.05）。2-PE对芽枝状枝孢霉、指状青霉菌、柑橘链格孢和意大利青霉菌菌丝生长的最小抑菌浓度分别为1.4、1.8、2.2和2.4 g/L。

关键词 脐橙病原菌;形态学观察;分子鉴定;2-苯乙醇;抑菌

中图分类号 TS255.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.053

Isolation and Identification of Citrus Pathogens from Navel Orange in Southern Jiangxi Province and Sensitivity Analysis to 2Phenylethanol Alcohol

XIONG Dawei， GU Bintao， LIU Lan et al

（Institution of Microbiology， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang， Jiangxi 330096）

Abstract Four citrus pathogens were isolated from rotten orange of Southern Jiangxi Province after harvesting. According to the observation of the morphological characteristics of fungi and the analysis of rDNAITS sequence， the four citrus pathogens were identified as Penicillium italicum， Penicillium digitatum， Alternaria citri and Cladosporium cladosporioides. The biopreservative 2phenylethyl alcohol can effectively inhibit the spore germination and hyphae growth of the four citrus pathogens， but the antibacterial effects of different saprophytic fungi were significantly different （P<0.05）. The minimum inhibitory concentrations for the hyphae growth of C. cladosporioides， P. digitatum， A. citri and P. italicum were 1.4， 1.8， 2.2 and 2.4 g/L， respectively.

Key words Citrus pathogens;Morphological observation;Molecular identification;2Phenylethanol alcohol;Antibacterial

基金项目 江西省重点研发项目（S2018ZPYFE1016）;江西省科學院重大研究专项（2018-YZD1-03）。

作者简介 熊大维（1975—），男，江西靖安人，助理研究员，从事微生物学研究。通信作者，研究员，硕士，从事生物工程及生物活性产物的制备和应用研究。

收稿日期 2019-10-09;修回日期 2019-10-28

近年来，我国柑橘产业发展迅猛，年产量超过2 900万t，由于成熟度相对集中，其贮藏加工业的发展远远滞后于种植业，每年鲜果在采摘后贮藏、运输和销售环节的损失巨大，果品腐烂率为10%～40%[1-2]，造成重大的经济损失。引起柑橘腐烂的病害有20多种，其中约90%的柑橘采后腐烂是由意大利青霉引起的青霉病，指状青霉引起的绿霉病和链格孢霉引起的黑腐病[3-7]。目前主要采用化学防腐剂进行防腐保鲜，由于存在病原菌对化学制剂易产生抗药性，且对人体健康具有一定危害和造成环境污染，已被陆续禁止使用[8-9]。

2-苯乙醇（2-PE）是一种具有玫瑰气味的芳香醇，广泛存在于自然界中，具有广泛的抗菌活性，可抑制大肠杆菌等G-菌和枯草芽孢、金黄色酿脓葡萄球菌等G+菌的生长，对酵母菌、青霉菌等真菌亦具有显著的抑制作用[10-12]。其在食品防腐保鲜上的研究也已经开展，刘普[13]研究表明生防菌柠檬形克勒克酵母菌对柑橘采后青、绿霉菌具有很好的防治效果，分离获得对抑制真菌的有效成分为该菌产生的2-PE。方静凡[14]发现2-PE对导致水果（如柑橘、苹果、葡萄等）腐败的许多真菌具有良好的防治效果，并对其最低抑菌浓度和抑菌机理进行了初步研究;采用产2-PE的酵母菌液涂抹，在果品上形成菌膜以达到生防效果。陈利军等[15]发现2-PE对植物病原真菌如草莓灰霉病菌、白菜黑斑病菌等具有显著的抑菌效果。

该研究从自然腐烂的脐橙中分离获得4种致腐真菌，通过形态学观察和分子学鉴定，确定了其种、属。针对这些致腐真菌，采用生物法转化合成的2-PE进行了抑菌试验，确定了2-PE对不同真菌的孢子萌发最小抑菌浓度（MIC）和菌丝生长最小抑菌浓度。由于2-PE具有较好的水溶性和稳定性，安全无毒，对真菌有较好的抑制作用，可开发为一种新型的生物防腐剂用于果蔬、食品的保鲜，为今后的植物病原菌的抑菌试验和抑菌机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脐橙摘自赣州（信丰县和安远县）不同果园，置通风处保存。2-PE粗提液，是由本实验室生物转化液经乙醇抽提浓缩而成的质量分数为80%～90%粗制品[16];马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

BX53型显微镜（日本Olympus公司）;Prachfum 224-1CN分析天平（德国Sartorius公司）;L204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）股份有限公司）;MJX-250B-Z霉菌培养箱（上海博迅医疗生物仪器有限公司）;CD-AX数显式游标卡尺（世达工具（中国）有限公司）;SW-CJ-ID型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）;LDZX-50KBS手轮型立式蒸汽灭菌锅（上海申安仪表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离纯化与鉴定。选择具有典型发病症状的脐橙，用75%乙醇清洗患处表面，再用无菌刀片切取病患交界处5 mm×5 mm的组织，用2%NaClO溶液表面消毒，无菌水冲洗3次，接入PDA平板培养基上，于（28±0.5）℃倒置培养，待菌丝长出后，用无菌接种针挑取前缘菌丝植入另一培养基内培养，重复上述操作3次即可获得纯化菌株。

1.2.2 真菌种属鉴定。

1.2.2.1 病原真菌形态学鉴定。通过观察病原体菌落特征和培养特佂，包括菌落大小、颜色、边缘、渗出物等，在显微镜下观察菌丝生长情况、孢子形态、产孢结构及有无横隔的特征，进而进行显微形态分类鉴定。参照真菌鉴定手册进行病原菌的初步鉴定[17]。

1.2.2.2 病原真菌的rDNA-ITS序列分析。

采用rDNA-ITS分子鉴定法对病原菌株进行分析。以不同病原菌的DNA作为模板，用通用引物扩增出约550 bp的rDNA-ITS序列，PCR反应条件：预变性94 ℃ 3 min;变性95 ℃ 1 min，退火54 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 40 s，35个循环;终延伸72 ℃ 10 min，保温4 ℃ 60 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于上海生物工程有限公司完成测序。将测序获得rDNA-ITS序列在GenBank核酸数据库中进行Blast搜索比对。

1.2.3 2-PE对病原真菌孢子萌发率的影响。将4种病原菌株分别于PDA斜面培养基中28 ℃培养6 d，分别加入10 mL无菌水，用玻璃棒洗下孢子，菌液再分别倒入20 mL注射器中，经4层无菌纱布过滤，收集孢子液，于4 ℃冰箱贮存备用。用血球计数器计数孢子浓度，稀释孢子液为10-4和10-5，涂布于含2-PE分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的培养基中，以不加2-PE的平皿为对照，每个梯度涂布3皿，于28 ℃培养3～6 d，计算孢子萌发率。

孢子萌发率（%）=处理平皿中菌落数对照平皿中菌落数×100（1）

1.2.4 菌丝生长抑制率的测定（采用菌丝生长速率测定法）。将4种病原菌孢子液分别涂布于PDA平皿中，于28 ℃培养6～7 d，用打孔器在培养基上打孔，取生长一致的菌苔，备用。配制含2-PE浓度为0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L的培养基，用量杯量取等量体积倒入平皿中，用￠5 mm打孔器切取生长一致的病原菌菌块，移植于含药剂的平皿中，每块平皿植入3块菌苔做平行试验，另设加无菌水的PDA培养基平板作为对照。置于28 ℃生化培养箱中培养，用游标卡尺测量菌落直径，取 120 h的菌落平均值計算菌丝生长抑制率，测定2-PE对病原菌的抑菌率[18]。

菌丝生长抑制率（%）=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-菌饼直径×100（2）

2 结果与分析

2.1 病原真菌的形态学鉴定

在真菌识别中，有形态学识别，如菌落形态、颜色、在不同时间的生长状态、菌丝及孢子的形态及大小等。从自然腐烂的脐橙中分离出4种真菌，分别编号为FZ-1、FZ-2、FZ-3和FZ-4，菌落形态及孢子生长描述如下。

2.1.1 FZ-1菌株。菌株在PDA培养基培养2 d后，菌落表面平整呈白色，少许菌落中间略微凸起并附有青绿色孢子，菌落稀疏蓬松;培养3 d后，菌落表面仍平整，表面呈青绿色，边缘呈白色，表面附有青绿色孢子，菌落稀疏蓬松。菌丝体由分枝的、分隔的、光滑的、透明至半透明的菌丝构成，菌丝2.7～6.0 μm宽。分生孢子梗与菌丝异形或同形，单菌丝构成，透明至半透明，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圆柱形，3.3～9.0 μm宽。产孢细胞单点芽植型产孢，（14.0～26.0） μm×（3.0～4.2）μm，轮生，每轮2～4个倒棒状或近圆柱形的产孢细胞，顶部变细，中间略膨大，基部平截，透明，顶生或侧生，光滑。分生孢子全壁芽植型，单生，孢子呈链状向上生长，质地干，未成熟时透明，成熟后半透明至淡灰黑褐色，光滑，壁薄，基部平截，顶部圆滑，无隔膜，部分近球形至球形，椭球形或倒卵形（5.0～12.5）μm×（4.2～10.1）μm（=7.8 μm×6.0 μm，n=45）;部分近圆柱形（8.4～24.0） μm× （2.8～5.5）μm（=15.0 μm×4.3 μm，n=35）;分生孢子裂解式脱落。还有一部分非常小的分生孢子，近球形或椭球形至球形（3.2～6.0）μm×（2.8～4.3）μm（= 4.2 μm×3.3 μm，n=45）。图1为FZ-1的菌落形态及菌丝和孢子生长状态。

2.1.2 FZ-2菌株。菌株在PDA培养基上培养2 d后，菌落表面凸起呈灰色，边缘菌丝呈白色，表面附有灰色的孢子，菌落浓密紧凑;培养3 d后，菌落表面仍凸起且颜色加深，边缘菌丝呈白色，表面附着大量的孢子，菌落浓密紧凑。菌丝体由分枝的、分隔的、光滑的、透明至淡灰褐色的菌丝构成，菌丝2～4 μm宽。分生孢子梗与菌丝异形或同形，单菌丝构成，半透明或浅褐色至中褐色，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圆柱形至近杯状，3～4 μm宽。产孢细胞多点芽植型产孢，半透明至浅褐色，与分生孢子梗整合，光滑，（9.0～28.0） μm×（2.5～5.0）μm（= 12.7 μm× 3.7 μm，n=20），内部有细小油滴。分生孢子全壁芽植型，多生，孢子呈链状向上生长，质地干，透明至浅褐色，近球形至球形，椭球状到近纺锤形或倒卵形，部分近圆柱形，基部和顶部平截，最顶端孢子基部平截，顶部圆滑，0-1（-2）隔，光滑，壁薄，（3.8～11.0）×（2.6～4.5）μm（= 6.8 μm×3.4 μm，n=50）;分生孢子裂解式脱落（图2）。

2.1.3 FZ-3菌株。菌株在PDA培养基上培养2 d后，菌落浓密不紧凑，表面灰白色至浅褐色，表面菌丝清晰可见，菌丝较分散，菌落中央无凸起，边缘菌丝呈白色;培养3 d后，菌落浓密不紧凑，颜色呈灰白色至深褐色，培养基反面深褐色至黑色。菌丝体堆在一起褐色;菌丝分枝，具隔膜，半透明至深褐色，表面光滑，壁薄，宽2.5～6.4 μm（3.8 μm，n=40）。分生孢子梗宽2.2～5.3 μm（3.9 μm，n=25），顶端产孢，表面光滑，褐色至中褐色。产孢细胞圆柱形，浅褐色至褐色，在分生孢子梗的顶端。分生孢子单生，顶生，（15.0～36.0） μm×（8.0～15.2）μm（23.6 μm×11.3 μm，n=40），基部平截2.4～4.5 μm（3.5 μm，n=40），隔膜网格状，具横隔膜和纵隔膜，横膈膜较多1～6个隔膜，纵隔膜一般1个，分孢子呈卵形、纺锤形，棍棒状、球形至椭球形，浅褐色至中褐色，表面光滑，壁薄（图3）。

2.1.4

FZ-4 菌株。菌株在PDA培养基上培养2 d后，菌落浓密紧凑，表面灰白色，菌落中央凸起呈灰白色，边缘菌丝呈白色;培养3 d后，菌落表面呈灰白色至浅青色，菌落浓密，表面可见灰白色孢子，培养基反面棕黄色。菌丝分枝，具隔膜，透明至浅色，表面光滑，壁薄。分生孢子梗宽2.6～4.5 μm（3.5 μm，n=20），表面光滑，透明至浅色，产孢细胞顶端集中呈扫帚状。产孢细胞顶生，烧瓶形瓶梗，（8.0～25.0）μm×（2.0～3.0）μm（16.1 μm× 2.6 μm，n=20），透明，壁薄，基部寬顶部窄。分生孢子顶生，数量非常多，散射状，（2.8～7.6）μm×（2.05～4.8）μm（4.55 μm× 2.88 μm，n=70），无隔膜，球形、椭球形至长椭球形，浅褐色至透明，表面光滑，壁薄（图4）。

2.2 病原真菌的分子学鉴定

利用18S和28S的上下游引物序列，得到以上4种病原菌菌株的序列结果（表1），与NCBI Blast 上的已知序列进行比对，以确定病原真菌种或亚种。

由表1可知，利用rDNA-ITS鉴定4种脐橙病原真菌分别如下：FZ-1为指状青霉（Penicillium digitatum），FZ-2为芽枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），FZ-3为柑橘链格孢（Alternaria citri），FZ-4为意大利青霉（Penicillium italicum），与各自源物种的同源性均达100%。

2.3 不同质量浓度的2-PE对4种病原真菌孢子萌发率的影响

2-PE对细胞具有一定的毒性，其抑菌作用主要是通过增加细胞膜的通透性而扰乱跨膜质子电势，以及作为大分子合成的抑制剂抑制细胞内蛋白质和RNA的合成。不同的微生物对2-PE的耐受性不同，通常质量浓度为0～2 g/L的2-PE可抑制大部分微生物生长，当质量浓度达4 g/L可完全抑制酵母菌生长[19]。由表2可知，2-PE对4种病原菌孢子萌发均有显著（P<0.05）的抑制效果，在浓度为0.6 g/L时可全部抑制柑橘链格孢和芽枝状枝孢霉的孢子萌发，对指状青霉和意大利青霉的最低孢子萌发抑制浓度分别为0.8和1.2 g/L，2-PE对意大利青霉的孢子萌发率抑制效果较弱。

2.4 不同质量浓度的2-PE对4种病原真菌的抑菌效果

2-PE对柑橘致腐菌均有很好的抑菌作用（表3）。在一定质量浓度下，2-PE对芽枝状枝孢霉的抑制效果最好，其次为指状青霉和柑橘链格孢，对意大利青霉的抑制效果相对较弱。其最小抑菌浓度（MIC）分别为1.4、1.8、2.2、2.4 g/L，即2-PE浓度达2.4 g/L时，可完全抑制4种病原菌菌丝的生长。方静凡[14]采用2-PE对多种果实病原真菌的抑菌谱进行检测，2-PE浓度为0.2%～0.4%（V/V）时可完全抑制柑橘绿霉菌、黑腐菌、炭疽菌，苹果青霉菌和灰霉菌等多种致腐真菌的生长，对意大利青霉菌B3的最小抑菌浓度MIC为0.25%（V/V）。

3 结论

从不同地区自然腐烂的脐橙中分离纯化出4种病原真菌，通过观察菌落形态，菌丝生长，分生孢子形状、大小及分生孢子梗形态等对其进行鉴定，由于真菌生长条件改变，菌丝的生长形态会有改变、厚垣孢子难形成和观察，分生孢子在形态学上差异小，对菌丝、孢子的描述困难，较难区分多种菌株之间的差异。随着分子生物学技术的发展，rDNA-ITS被广泛应用于果蔬类采后病原菌的分离和鉴定[20-22]。通过18S rDNA测序以及在GenBank核酸数据库中进行Blast比对，结果表明这4种柑橘致腐菌分别为意大利青霉、指状青霉、柑橘链格孢和芽枝状枝孢霉。其中意大利青霉、指状青霉和柑橘连格孢为引起柑橘采后腐烂的主要病原真菌。利用分子学技术进行辅助鉴定，可以鉴定出亲缘关系较近的种、属。

2-苯乙醇对柑橘致腐菌的孢子萌发和菌丝生长均有较强的抑制效果，2-PE可在较低的质量浓度下完全抑制真菌孢子萌发，相较于酵母菌和真菌菌丝，真菌孢子对2-PE具有更高的敏感性，可能是孢子在萌发过程中蛋白质和RNA的合成更易受到2-PE的抑制。在相同的质量浓度下，2-PE抑制4种病原真菌孢子萌发的强弱顺序依次为芽枝状枝孢、柑橘链格孢、指状青霉、意大利青霉，浓度为1.2 g/L时可完全抑制病原菌孢子的萌发。而在相同的质量浓度下，2-PE对芽枝状枝孢霉菌生长的抑菌效果最强，其次为指状青霉、柑橘链格孢，对意大利青霉抑菌较弱，在浓度为2.4 g/L时可完全抑制4种病原真菌的生长。该研究从采后腐烂的赣南脐橙中分离出主要的致腐真菌，并采用生物转化的2-PE进行了抑菌效果评价，为进一步开发新型果蔬保鲜生物保鲜剂2-PE奠定了基础。

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