贺 丹，敖慧娟，杨 迪，王家敏，柏家林

（1.西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学实验教学部，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；4.西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，常引起不同程度的流行，包括世界性大流行、局部暴发和散发。禽流感是由甲型流感病毒亚型引起的一种急性传染病，也可感染人类。人类感染禽流感的死亡率通常为33%[1-3]。到目前为止，由于还没有找到治疗流感和禽流感的理想药物，接种疫苗仍然是预防流感疾病发生和流行的最有效方法[4]。Madin-Darby犬肾细胞（MDCK细胞）是由Madin和Darby于1958年建立的，来源于一只可卡犬的肾组织。由于其感染效率高、增殖快、无突变等特点，被认为是三种适合流感病毒复制的细胞系之一[5，6]。目前，由MDCK细胞生产的几种流感疫苗已获得国际认可。用MDCK细胞作为病毒复制的底物在流感疫苗生产中仍有争议，因为它具有成瘤性[7，8]。实验表明，皮下或肌肉接种肿瘤细胞系可引起裸鼠肿瘤，如果流感疫苗是从肿瘤细胞系中衍生出来的，癌基因会随着接种而整合到人体内，从而对人体健康构成潜在威胁。目前，非肿瘤性MDCK细胞系的建立仍是各国疫苗研究的重点[9]。

长链非编码RNA（lncRNA）是指一类长度大于200个核苷酸且不编码蛋白质的非编码RNA。越来越多的研究表明，高达90%的非编码蛋白在人类基因组中也扮演着更重要的角色，而不是所谓的“转录噪音”。根据lncRNA相对于蛋白质编码基因的位置，将其分为五类：基因间lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA、反义lncRNA和增强子lncRNA。不同类型的lncRNA可能具有不同的生物学功能。对长非编码RNA的功能研究表明，它在表观遗传学、转录和转录后调控等方面发挥着重要作用，从而影响了多种生物学过程[10]。近年来，随着高通量测序技术的发展，越来越多的功能性lncRNA被发现。已经发现lncRNA通过调控抑癌基因影响肿瘤的发生和发展，进一步的研究揭示了lncRNA在肿瘤中的作用机制[10，11]。随着对lncRNA研究的深入，可以不断揭示肿瘤的相关特征和机制，为寻找新的治疗靶点提供方向。本研究基于第二代高通量测序技术对高成瘤性MDCK母细胞系和两株低成瘤性单克隆细胞系中lncRNA的特性进行的测序，随机验证6个lncRNA，并对高/低成瘤性的MDCK细胞的lncRNA的靶基因进行了预测，为建立成瘤性更低的细胞株提供依据。

1 材料和方法

1.1 总RNA抽提

收取MDCK-W73、MDCK-C35以及MDCK-C09细胞（6孔板80%细胞密度），放在1.5ml新的无RNase 的离心管中，加入Trizol 500μl, 置于冰上5 min，细胞得到充分裂解。为去除沉淀，4℃ 12 000 g，离心5 min；每管加入氯仿200μl，振荡混匀，冰上静置15 min。4℃ 12 000 g，离心15 min，小心吸取上清200μl，加入到新的1.5 ml预冷的无RNase离心管中。在新的1.5 ml离心管中加入等体积预冷的异丙醇，振荡混匀后冰上放置10 min；4℃ 12 000 g，离心10 min后弃上清，保留沉淀。加入用DEPC水新鲜配制500 ml 75%乙醇，将沉淀轻轻重悬；离心5 min，4℃ 8 000 g，去除大部分上清液，保留沉淀；室温放置5 min，使残留液体挥发。待RNA沉淀基本透明时，加入无DNase/RNase ddH2O（加入体积视RNA沉淀量而定）至完全溶解，-80℃保存备用。利用NanoDrop2 000对所抽提RNA浓度和纯度进行检测。将样品在冰上融化后，充分混匀并离心，取适量样品进行RNA完整度RIN值的检测，检测仪器使用Agilent2 100。一份用于测序分析，一份保留进行lncRNA的验证分析。

1.2 反转录获得cDNA

细胞总RNA中去除DNA的反应，按表1的体系和操作流程，去除DNA。室温放置5 min，保存于4℃中。在冰上进行反应体系，混匀，短暂离心；反应温度及程序设置：25℃反应5 min，42℃水浴反应1h，70℃水浴15 min（使RT酶失活），将得到的RT产物cDNA置于-20℃保存。

表1 试剂及反应体系

1.3 实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测成瘤相关基因表达

收取细胞，提取RNA，反转录后，使用实时荧光PCR仪进行检测。按照All-in-one SYBR Green 实时荧光定量PCR试剂盒操作说明书对反应体系进行配置。测序报告中随机挑选6个显著差异表达lncRNA进行引物设计，引物序列如表2所示。利用β-actin作为内参基因进行不同基因相对表达量的分析。反应程序为：95℃预变性10 s，95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸15 s，共四十个循环。

1.4 数据分析

使用相对定量分析F=2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值；-ΔΔCt=NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各样品相对NC组样品目的基因的相对表达水平。

1.5 lncRNA的靶基因预测

lncRNA靶基因预测是基于lncRNA与靶基因不同作用方式，可以将其预测分为顺式（cis）和反式（trans）两部分。对于样本数少于6的样本，采用cis作用来预测lncRNA的靶基因。Cis作用是lncRNA的一种靶基因作用方式。利用基因组注释和基因组浏览器鉴定lncRNA的可能的靶基因。一般是指lncRNA上下游100 kb范围内的基因。启动子区域同向转录的靶基因一般是促进表达作用，反向为抑制。而在3’-UTR区域时，部分情况下反向也为促进表达。

2 结果

2.1 总RNA提取与质检结果

使用NanoDrop2 000分析测定所抽提RNA浓度纯度，使用琼脂糖凝胶电泳测定抽提RNA的完整性。从表3所列实验结果看出，所有样本的OD260/280均分布于2.01～2.08之间，OD260/230均分布于2.05～2.13之间，提示提取的RNA纯度高。

使用Agilent2100进行RIN值的检测。图1每个峰的集中度，代表样品中RNA完整度，峰越集中代表样品RNA降解率越低；RIN值表示RNA样品的完整度，数值在1～10，数值越高代表RNA完整度越好。

表2 引物序列信息

表3 RNA纯度检测结果

图1 Agilent测定抽提RNA的完整度

图2 lncRNA的qRT-PCR的相对表达量和lncRNA-seq测序（FPKM）数据对比

2.2 qRT-PCR与高通量测序（lncRNA-Seq）的数据对比

在MDCK-W73、MDCK-C09和MDCK-C35中，各lncRNA的相对表达量如图2所示。试验结果显示，lncRNA在各组中均有表达，与lncRNA-Seq进行对比可以发现，qRT-PCR与lncRNA-Seq的差异性表达相一致。由此说明，lncRNA-Seq测序结果真实可靠，为后续的试验的开展奠定了良好的基础。

2.3 lncRNA靶基因预测

Cis作用是lncRNA的一种靶基因作用方式。利用基因组注释和基因组浏览器鉴定

lncRNA的可能的靶基因。一般是指lncRNA上下游100kb范围内的基因。Cis预测结果可以表述lncRNA的id、lncRNA靶基因的id、lncRNA所在染色体、lncRNA所在链、靶基因位置（上游或是下游）以及靶基因离lncRNA的距离。根据lncRNA-Seq结果共获得63个cis作用靶基因，表4所列为部分lncRNA靶基因的预测结果。

3 讨论

大规模的转录组研究分析已经获得了各种各样的非编码RNA的产物。非编码RNA是所有不编码蛋白质功能RNA的统称。长度超过200个核苷酸的哺乳动物和植物的非编码RNA被称为长链非编码RNA（lncRNA）。H19是发现的第一个特异性来源于母系的lncRNA。lncRNA H19在人类胚胎中高度表达出生后，上调H19可通过调节ID2基因[12]的表达诱导膀胱癌细胞增殖。MEG3是第一个被证实对肿瘤有抑制作用的lncRNA。lncRNA-MEG3的表达受表观遗传学控制在许多癌症类型中，MEG3是CPG甲基化异常，通过激活p53[13，14]调节癌细胞凋亡。目前的研究表明PCA3、PCGEM1和PCAT1是前列腺癌中高表达的lncRNA，可作为有效的生物标记物[15]。对于lncRNA的研究，荧光定量PCR技术比较普遍，实验方法也较为成熟。但是在研究的过程中由于lncRNA的结构比较复杂，在引物设计过程中要考虑lncRNA存在序列重叠区，应避免以此部分设计引物。lncRNA反转录引物设计是根据lncRNA序列的3’端设计出的配对引物，β-actin作为内参基因。试验根据扩增后的溶解曲线来分析反应的特异性，作为鉴别的依据。采用2-ΔΔCt数据分析方法对每个基因的三次重复数据进行相对表达量分析，并与lncRNA的测序结果进行比对。

表4 lncRNA靶基因预测的结果（部分）

lncRNA是通过调控邻近发挥生物学功能，因此通过邻近基因的分析可以为后续lncRNA的功能研究提供线索。Cis作用预测靶基因的意义在于，对于感兴趣的差异表达lncRNAs，搜索其上下游100K范围内的所有编码基因，并与该lncRNAs 有显著共表达的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该lncRNAs 所调控。而trans作用预测靶基因是计算lncRNAs 共表达的编码基因，集合与转录因子/染色质调控复合物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与lncRNAs 显著相关的转录因子，从而识别可能与lncRNAs 联合发挥调控作用的转录因子/染色质调控因子[16]。

lncRNA的组织特异性及特定的细胞定位，显示lncRNA受到高度严谨的调控，目前已知其与发育、干细胞维持、癌症及一些疾病相关。随着近年来随着基因芯片及第二代高通量测序技术的广泛运用，lncRNA不断被发现，其作用机制也会不断被人类所知。