蒋 敏,李 会,史劲松

(江南大学 药学院， 江苏 无锡 214000)

0 引 言

药理学实验是药学专业实验课的重要组成部分，其旨在培养学生动手、观察和解决问题的能力[1]。目前单一的验证性实验依旧是各校采用的一种教学模式，这一传统模式并不利于培养创新性应用型药学人才，与我国医药事业快速发展的需求不相匹配，因此，各大院校均致力于大力增加设计性实验课程占比，将传统的验证性实验转变为设计性实验，旨在调动学生学习积极性，提高应用知识、分析解决问题的能力[2]。

随着人们生活水平的日益提高，酒精性肝损伤已成为世界各国共同面临的健康问题，因此研制出能够预防和治疗急性酒精性肝损伤的解酒食品、药品有着重要的临床意义。我校制药工程专业拥有一支高水平的师资队伍和优良的硬件条件，近些年积极开展药理学实验教学改革，推进设计性实验教学工作。本设计性实验依托于学院科研成果，选择与生活实际密切相关的解酒保肝为切入点，建立小鼠中、高剂量饮酒模型，对前期研究成果-文蛤酶解反应深加工产品进行评价，通过实验学生一方面可直接从小鼠的行为学观察到解酒效果，还可通过生化、组织病理学等检测手段从技术角度辅证解酒保肝效果。本综合性实验由学生自由建组，在老师指导下完成实验设计与方案，小组内分工合作完成任务，以期提高学生的综合处理问题能力。

1 实验原理

文蛤，是我国重要的海洋贝类之一，其肉鲜，营养丰富，富含人体必需的氨基酸、矿物质等，现代药理学研究表明文蛤及其酶解物在抗肿瘤、保肝脏、提高免疫等方面均表现出一定的功效。文蛤酶解产物是本院科研组较为成熟的科研成果，该酶解物整体风味良好，富含具有抗氧化[3-4]、保肝护肝[5]的活性多肽(21.8 g/L)、游离氨基酸(牛磺酸、丙氨酸、谷氨酸等，4.15 g/L)等[6]活性物质，可明显对抗醉酒第二阶段的共济失调现象[7]，延长小鼠在转棒疲劳仪上的停留时间，还能明显延长小鼠醉酒耐受期，缩短小鼠醉酒睡眠时间，同时减少因急性酒精中毒引起的肝脏损伤。

2 试剂及仪器

试剂及溶剂：红星二锅头(56°)，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，一氧化氮(NO)试剂盒均采购于南京建成海浩生物科技有限公司；文蛤酶解产物按照文献[6]中方法制备，即取文蛤肉，加水匀浆，加热至50°C，再依次添加75 u/g中性蛋白酶、75 u/g复合蛋白酶进行二段酶解，酶解温度为45°C，水解3 h，随后加入50 u/g风味蛋白酶，50°C酶解1 h，离心取上清，喷雾干燥，即得。实验前将其配置成0.1 g/mL溶液，待用。

实验动物：昆明种雄性小鼠(体重25～30 g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司),动物饲养温度(23±2)°C，相对湿度(50±5)%，自由进食和饮水。

仪器：转棒仪；全自动生化分析仪；石蜡切片仪；低温高速离心机；紫外分光光度计；电子天平。

3 操作方法

3.1 评价文蛤酶解产物对中剂量饮酒引起小鼠平衡失调的缓减作用

参考文献[8]方法，取20只小鼠，本实验环境下适应喂养1周，禁食12 h后，随机分成2组，每组10只，分别为模型组、实验组，模型组先按照体重灌胃8 mL/kg的生理盐水，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，实验组先按体重灌胃8 mL/kg的文蛤酶解产物，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，记录给药时间、给酒时间。灌胃结束后分别在30、60、90 min时将小鼠放入疲劳仪转棒上，将疲劳仪转速设置为20 r/min，记录小鼠在棒停留时间。

3.2 评价文蛤酶解产物对高剂量饮酒引起小鼠急性肝损伤的保护作用

3.2.1 实验分组与给药

取30只小鼠，本实验环境下适应喂养1周，随机分成3组，每组各10只，分别为正常组、模型组和实验组，取模型组和实验组两组小鼠按照以下方法灌胃：模型组：8 mL/kg的生理盐水，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒；实验组：灌胃8 mL/kg的文蛤酶解产物，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒，记录时间。

3.2.2 翻正反射观察

灌服白酒后随机观察小鼠活动情况。以小鼠爬行不稳、闭眼懒动、后腹拖地为醉酒指标，以行动灵活、精神恢复为醒酒指标，记录小鼠醉酒时间和醒酒时间，计算小鼠醉酒潜伏期(从灌酒至醉酒的时间)和醉酒持续时间(从醉酒至醒酒的时间)[9-10]。

3.2.3 生化指标检测与病理学观察

参照文献[11]方法，末次给酒12 h后取正常组、模型组和实验组3组小鼠摘眼球取血，断脊椎处死小鼠。血液离心(4 000 r/min)后分离血清，全自动生化分析仪检测ALT 与AST水平。

摘取肝脏，取肝脏同一部位，生理盐水反复冲洗，滤纸吸干后，准确称取组织重量，按重量体积比1∶9的比例加入生理盐水，制成10%(w/v)的组织匀浆，低温离心10 min(3 000 r/min)，取上清液按照试剂盒操作说明检测SOD、MDA、NO。同时取肝脏固定部位组织存放于10%中性福尔马林液中固定24 h后转移至75%乙醇，脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察病理学变化。

3.2.4 数据处理

所有数据均采用mean±SD表示。所有数据采用GraphPad Prism 5统计软件进行One-way ANOVA分析，组间比较用t-test法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

4 实验结果

4.1 文蛤酶解产物对中剂量饮酒引起小鼠平衡失调的缓减作用

不同组小鼠在疲劳仪上的停留时间如图1所示。由该图可见，在30、60、90 min时模型组小鼠在转棒上的停留时间均在4 s以内，且不随时间的延长而变化，说明在90 min内小鼠仍旧处于醉酒状态。而与模型组相比，实验组小鼠在疲劳仪上的停留时间明显延长，并且随着时间的延长而显著增加，当90 min时，实验组的小鼠的停留时间是模型的4倍。实验结果提示文蛤酶解产物能显著缓解酒精引起的小鼠运动失调。

图1 不同组小鼠疲劳仪停留时间(*：p<0.05)

4.2 文蛤酶解产物对高剂量饮酒引起小鼠急性肝损伤的保护作用

4.2.1 醉酒潜伏期和醉酒持续时间

不同组小鼠饮酒后醉酒潜伏期与醉酒持续时间如图2所示。由图可见，模型组小鼠醉酒潜伏期为20 min，而实验组小鼠的潜伏期是模型组小鼠的两倍，显著高于模型组(p<0.05)。模型组小鼠的醉酒持续时间长达160 min，而实验组小鼠醉酒时间是模型组的63%，显著低于模型组(p<0.05)。结果提示，文蛤酶解产物具有显著的防醉解酒效果。

图2 不同组小鼠醉酒潜伏期和醉酒持续时间(*：p<0.05)

4.2.2 血液指标

ALT、AST是医学临床上常用用的评价肝脏功能的两个重要肝功能酶。正常情况下，血清中ALT与AST含量极少，当肝脏组织受损导致肝细胞遭到大量破坏后，肝细胞中的ALT、AST释放入血清，导致血清中ALT、AST活性明显增强[12]。

不同组小鼠血清中AST与ALT检测结果如表1所示。与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中ALT、AST明显升高(p<0.05)，说明高剂量饮酒会直接造成肝细胞受损，这与文献报道相一致[13]。实验组小鼠的ALT以及AST与模型组相比均显著下降，说明文蛤酶解产物能够预防酒精对肝脏组织的损伤(p<0.05)。

表1 不同组小鼠血清中AST与ALT的比较

注：a表示与正常组有显著性差异；b表示与模型组有显著性差异，p<0.05

4.2.3 肝脏组织指标

酒精经肠道吸收后，在肝脏经乙醇脱氢酶和非乙醇脱氢酶系统代谢后形成大量自由基和MDA等一系列脂质氧化代谢物。SOD是肝脏中一种重要的抗氧化酶，能清除自由基和过氧化物，防止对细胞和机体的损伤[14]。因此，肝脏损伤越严重，肝组织中MDA含量就越高，SOD水平下降就越明显。与先前研究结果相一致[15]，在酒精性肝损伤模型小鼠中，MDA含量显著高于正常组(p<0.05)，SOD水平显著降低(p<0.05)(见表2)，提示在氧化应激状态下，小鼠肝细胞严重受损。而灌服文蛤酶解产物后，MDA水平显著下降(p<0.05)，SOD水平显著提高(p<0.05)，表明文蛤酶解产物对酒精引起的氧化反应具有很强的抑制作用，并能降低自由基积累。

表2 不同组小鼠肝组织匀浆中MDA、SOD、NO含量

注：a表示与正常组相比有显著性差异(p<0.05)；b表示与模型组相比有显著性差异(p<0.05)

正常情况下，NO在肝脏中发挥微循环功能调节信使，在肝脏中含量水平较低，但是在氧化应激状态下，肝脏会应急性持续生成、释放大量NO，而此时产生的大量NO是肝损伤炎症的重要促进因子，对肝脏产生毒性作用，因此NO是肝细胞氧化应激的关键分子之一[16]。结果提示，模型组小鼠NO水平显著高于正常组，而在饮酒前灌服文蛤酶解产物能够抑制NO的生成(p<0.05)，说明文蛤酶解产物能够预防酒精引起的氧化损伤。

4.2.4 肝脏组织病理切片

肝组织切片如图3所示。正常组小鼠肝索排列整齐，肝组织结构正常，而模型组小鼠肝细胞排列紊乱，肝细胞中出现大小不一的脂肪空泡，这与文献[17]报道相一致；实验组小鼠肝细胞排列整齐，肝细胞无明显的脂肪变性。

(a) 正常组

(b) 模型组

(c) 实验组

5 结 语

(1) 结合疲劳仪与翻正反射实验，可通过动物行为学直接观察小鼠醉酒情况，实验难度适中，实验课时合理，有助于提高学生药理学动物实验基本操作技能。

(2) 生化分析技术与病理学切片技术已在药理学科研领域得到全面普及，本综合性实验要求学生熟练掌握解剖、取血等技能以获取血液、肝组织样本，进行指标检测及肝组织病理切片，对培养学生综合实验技能和科研素养有重要的意义。

(3) 实验结束后合理引导学生利用专业数据处理软件对不同组别数据进行计算分析，有助于培养学生建立数据分析观念，提高数据分析能力。