李剑美 ，李学玲 ，，陈锦盛 ，周仕顺 ，陶 川 ，，漆丽萍 ，赵 锋 ，*

（1.云南省高校民族医药资源研究东南亚国际合作重点实验室，云南 普洱 665000；2.云南省高校亚热带药用食用资源开发与利用重点实验室，云南 普洱 665000；3.普洱学院生物与化学学院，云南 普洱 665000；4.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 勐腊 666303）

2010版《中国药典》规定使用的白芨药材为兰科植物白芨 (Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥块茎[1]。位于滇西南地区的普洱市拥有世居民族有14种，野生植物资源丰富，在治疗常见病、多发病方面有着独特的症疗经验和用药习惯[2-4]。李剑美等[5]在调查普洱野生药材市场时发现筒瓣兰 (当地名为小白芨)、苞舌兰 (当地名为土白芨)、小白芨代替白芨使用的现象普遍，其中，以筒瓣兰尤甚。目前笔者尚未见关于筒瓣兰、苞舌兰化学成分的报道。本实验首次对筒瓣兰、苞舌兰的化学成分进行预实验，以明确其可能的化学成分[6-9]，同时利用中国药典白芨的薄层色谱法鉴别三者的异同，初步探知他们的化学成分的类型及其差异，试探讨白芨及其替代品之间的相似性，为寻找治疗支气管炎和久咳伤肺的新药材资源奠定理论基础。

1 材料与仪器

材料：普洱市药材市场共发现有2种常见的白芨代用品分别“小白芨”、土白芨，对其原植物追踪调查，经中国科学院西双版纳热带植物园标本馆周仕顺工程师鉴定为兰科植物的筒瓣兰和苞舌兰。取一定量的白芨 (中国食品药品检定研究院，批号：121262-201405)及筒瓣兰、苞舌兰的假鳞茎切成薄片，在45～50℃的鼓风干燥箱中干燥后粉碎，过0.25mm的筛，得粗粉。

仪器：手提式药材粉碎机 (LK-200A)、电子天平 (SHIMADZVAY120)、数控超声波清洗器(KQ3200DE)、DK-S26型电热恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司)、三用紫外仪 (CAMAG REPROSTAR3)，紫外分光光度计 (UV-2550)。

2 方法

2.1 化学成分预试验

2.1.1 水提取液制备

分别取白芨、筒瓣兰、苞舌兰的粗粉各10 g，加蒸馏水100 mL，在室温下浸泡过夜，滤液和药渣在50～60℃水浴加热1 h，过滤，滤液即为热水提取液，用作总糖、还原糖、皂苷的检查。

2.1.2 乙醇提取液制备

分别取白芨、筒瓣兰、苞舌兰的粗粉各10 g，加95%乙醇100mL，加热回流1h，过滤，滤液分为两部分。一份作为乙醇提取液，用作酚类的检查。另一份继续加热至无醇味，约为10mL，再一分为二，其中3mL放冷后加5%盐酸溶解，过滤，滤液作为生物碱的检查；另外7mL加95%乙醇5mL、石油醚10mL、水3mL，分离出醇液，再加30mL 95%乙醇，用作黄酮类、蒽醌类的检查。

2.1.3 石油醚提取液制备

分别取白芨、筒瓣兰、苞舌兰的粗粉各2g，加10mL石油醚 (60～90℃)，密塞，室温放置3～4h，过滤，滤液即为石油醚提取液，用作挥发油、油脂、甾体或三萜类成分的检查。

2.1.4 预试方法

采用《天然药物化学》和《中药化学》介绍的传统试管预试方法进行[10-11]。

2.2 黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取在120℃下干燥至恒重的芦丁标准品 (98%)54mg，用40mL 60%乙醇，置水浴锅上微热使溶解,放冷至室温，用60%的乙醇定容至50mL，摇匀得浓度为1.008mg/mL的标准储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取约2g样品，加40mL 95%乙醇，浸泡20 min，超声波提取30min，抽滤。滤渣再加40mL 95%乙醇，浸泡20min，再次超声波提取30 min，抽滤，合并两次滤液，得供试品溶液。

2.2.3 芦丁标准曲线绘制

准确称取芦丁标准品 (98%)5.4mg，用60%乙醇溶解，定容至 5mL，得浓度为1.008mg/mL的标准储备液。分别准确吸取标准储备液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL 于 7 只 25 mL容量瓶中，加10mL 30%乙醇和5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10%Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加1mol/L NaOH溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置10～15min，用UV-2550紫外分光光度计于500nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

2.2.4 黄酮样品浓度含量的测定

准确吸取供试品溶液1.00mL，按2.2.3的“加10mL 30%乙醇和5%NaNO2溶液1.0mL.......放置10～15min”操作，用UV-2550紫外分光光度计于500nm波长处测定吸光度并计算样品黄酮浓度。

w （黄酮） =[（C×V×N） /m] ×100%

其中：C根据所测定溶液的吸光度值，代入回归方程计算出相应的总黄酮含量；m为试验称取筒瓣兰的质量；N为稀释的倍数；V为测定时筒瓣兰的定容体积

2.3 总糖和还原糖的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备

准确称取烘干至恒重的葡萄糖对照品100mg，置于100mL容量瓶中，加水配置成1mg/mL溶液。然后分别精密量取10mL置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得0.1mg/mL的葡萄糖溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

取样品，60℃烘烤4h，粉碎，过40目筛，精密称取0.200g，加入20mL石油醚于100mL平底烧瓶中，水浴回流30min，放冷，滤过。待滤渣中的石油醚挥干后，滤渣连同滤纸置于平底烧瓶中，加入20mL蒸馏水，沸水浴中放置2h，放冷，滤过，以蒸馏水洗涤3次，合并滤液于50mL量瓶中，定容。精密吸取1mL作为测定还原糖的供试品溶液;另取1mL，定容至25mL，精密吸取1mL作为测定总糖的供试品溶液。

2.3.3 总糖标准曲线的绘制

分别吸取0.1mg/mL葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10ml带塞子的试管中，用蒸馏水补至1.0mL，空白对照为蒸馏水1.0mL，各加入蒽酮试剂5mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量 (μg)为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。

2.3.4 还原糖标准曲线绘制

分别吸取1mg/mL葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于25mL带塞子的试管中，用蒸馏水补至2.0mL，空白对照为蒸馏水2.0mL各加入3,5-二硝基水杨酸1.5mL，将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀。在540nm波长下，用1号管为参比管调零，分别读取各管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标绘制标准曲线。

2.3.5 总糖和还原糖样品浓度测定

准确吸取样品供试品溶液0.5 mL(取3份)，置于10mL带塞子的试管中，加蒸馏水补至1.0 mL，加蒽酮试剂5mL，迅速振摇混匀，以蒸馏水制备液为空白，在620nm处测其吸光度值测吸光度，利用回归方程计算总糖样品浓度。

2.3.6 总糖和还原糖计算方法

其中：C为在标准曲线上查出的总糖含量 (mg）；V总为提取液总体积（mL）；V测为测定时取用体积（ml）；D为稀释倍数；W为样品重量（g）

2.4 薄层色谱鉴定

薄层色谱比较鉴定按中国药典的相关要求进行规范操作。具体方法为：取中药白芨和替代品（筒瓣兰、苞舌兰） 粉末各2g，加70%甲醇20mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用乙醚振荡提取2次，每次20mL，合并乙醚液，浓缩至1mL，作为供试品溶液。参考薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液5～10 uL，中药白芨样品分别与替代药材两两滴于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1） 为展开剂，展开，取出、晾干，置紫外灯（365nm）下检视显色结果。

3 结果

3.1 化学成分系统预试验结果

根据各类成分特有的化学反应如颜色反应、沉淀反应等做一般定性预实验，从而得知供试品溶液中可能含有的化学成分类型。结果见表1～2。

3.2 白芨及其代用品黄酮、总糖、还原糖含量结果分析

3.2.1 芦丁标准曲线

以吸光度A对浓度c做标准曲线如图1所示，线形回归方程：A=0.0096C+0.0027，R2=0.9961。表明芦丁在0～48.384ug/ml范围内浓度与吸光度有良好的线性关系。

3.2.2 葡萄糖标准曲线

表1 白芨及其代用品水供试液、石油醚供试液成分预试结果

以吸光度A对浓度c做标准曲线如图2所示，线形回归方程：A=49.4491C-0.0532（R2=0.9916），表明葡萄糖在0～0.01mg/ml范围内浓度与吸光度有良好的线性关系。

表2 白芨及其代用品乙醇供试液成分预试结果

图1 芦丁标准曲线

图2 葡萄糖标准曲线

图3 还原糖标准曲线

“+”表示阳性，“-”表示阴性

3.2.3 还原糖标准曲线

以吸光度A对浓度c做标准曲线如图3所示，线形回归方程：A=16.7C-0.0266，R2=0.9985。表明葡萄糖在0～0.048 ug/ml范围内浓度与吸光度有良好的线性关系。

根据以上标准曲线换算后，分别测得白芨、筒瓣兰、苞舌兰的总糖、还原糖和黄酮的平均值见表3，对三种植物的结果进行单因素方差分析。白芨、筒瓣兰、苞舌兰的总糖、还原糖和黄酮均存在显著差异（Dunnett T3,P＜0.001）。其中总糖：白芨＞筒瓣兰＞苞舌兰，且三者之间均呈显著差异；还原糖：白芨＞苞舌兰＞筒瓣兰，苞舌兰和白芨之间差异未达到显著差异水平，但二者均与筒瓣兰呈显著差异；黄酮：筒瓣兰＞白芨＞苞舌兰，且三者之间均呈显著差异。

表3 白芨总糖、还原糖和黄酮含量统计表

3.3 薄层色谱研究结果

如图4和图5显示，从薄层斑点的数目、位置等特征可以有效地区别白芨、苞舌兰、筒瓣兰3种同科同亚组的植物。跑板以后将其置于365nm的紫外灯下检视，由图5可知：白芨共有5个蓝紫色荧光点，其Rf值依次为2.53cm，4.10cm，4.50cm，4.95cm和5.55cm；筒瓣兰有2个蓝紫色荧光点，其Rf值分别为4.10cm和4.95cm；苞舌兰有3个蓝紫色荧光点，其Rf值依次为2.53cm，4.10cm和4.50cm。将板浸入到浓硫酸显色，迅即拿出用吹分机吹干，得图4可知：白芨共有8条显色带，其Rf值依次为1.60cm， 2.53cm， 3.20cm， 3.75cm， 4.10cm，4.50cm，4.95cm，5.55cm；筒瓣兰共获得9条显色带，其Rf至依次为1.60cm，2.14cm，2.53cm，3.06cm， 3.50cm， 4.10cm， 4.50cm， 4.95cm，5.55cm；苞舌兰共获得8条显色带，其Rf至依次为1.60cm，2.14cm，2.53cm，3.06cm，3.50cm，4.10cm，4.50cm，5.55cm。

图4 白及及其代用品薄层色谱 (浓硫酸显色)

按照2010版《中国药典》检测要求，在365nm处苞舌兰与筒瓣兰共有3个（Rf2.53cm，4.10cm和4.50cm值） 和2个荧光点（Rf4.10cm和4.95cm）与白芨一致，说明说明筒瓣兰、苞舌兰与中药白芨成分相似，具有一定的代替价值。该检测方法下白芨的特征带清晰、数量多，苞舌兰、筒瓣兰的特征带较少、清晰度较差，说明此检测方法适用于白芨药材的鉴别，可能相较于筒瓣兰和苞舌兰的色谱条件还应在进行摸索改进，但是同时也再次验证了此检测方法适用于白芨药材的鉴别。

图5 白及及其代用品薄层色谱 (365nm)

4 讨论

4.1 关于白芨、筒瓣兰和苞舌兰化学成分预实验

系统的化学成分预实验的实验结果表明：白芨、筒瓣兰、苞舌兰三种植物的化学成分非常相似，均含有氨基酸、糖类、甙类、鞣制、有机酸、生物碱、皂苷、黄酮类、酚类、内酯、香豆素及其苷类、强心苷、甾萜类等物质，其中以多糖和黄酮类反应比较明显。他们所含的这些化学成分具有多种生理活性和应用前景，例如，黄酮类化合物是治疗心血管系统疾病的重要药物、还具有保肝、抗菌、抗病毒、解痉等作用[12]；多糖是所有生命有机体的重要组成成分和维持生命所必需的结构材料[13]；多数生物碱都具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒以及抗血小板凝集、抗心律失常以及抗高血压等心血管疾病的作用[14]。

4.2 白芨及其代用品黄酮和多糖的含量比较

白芨、筒瓣兰和苞舌兰虽然均含有总糖、还原糖和黄酮，但是其含量具有差异显著性，其中常用中药白芨总糖和还原糖的含量均显著高于二者，而筒瓣兰总黄酮量高于中药白芨。筒瓣兰在滇南地区常用于治疗久咳、支气管炎，部分民间医生还利用其治疗心脏疾病，这可能与其含有较高的黄酮类化合物有关。

新药资源的开发理论依据之一是利用近缘属种植物成分的相似特点，发掘新资源的方法。白芨、筒瓣兰、苞舌兰属于同科植物，其药用部位均为假鳞茎，综合以上的化学成分预实验定性分析和其反应较为显著的多糖和黄酮的定量分析，代用品与白芨正品间大类成分极为相似，说明替代品具有一定的代用价值；多糖的含量白芨显著高于替代品，总黄酮的含量筒瓣兰显著高于白芨和苞舌兰，说明白芨作为常见中药的客观性，也揭示了筒瓣兰在某些药效方面可能要强于中药白芨。应加强筒瓣兰的具体化学成分和药理作用的研究，以期能够发掘新的药物资源。

4.3 白芨及其代用品薄层色谱的比较

正品白芨和几种代用品来源相近，都属于兰科、兰亚科、树兰组族植物，药用部位均属于鳞茎。通过薄层色谱也可看出，苞舌兰与白芨荧光点最近，筒瓣兰次之。从亲缘关系越近其化学成分越相似可初步推断苞舌代用价值最高，其次是筒瓣兰。

滇西南地区是一个多民族边疆地区，受历史、地理、文化和交通等因素的影响，形成了极具地理性和民族性的医药系统，在治疗常见病、多发病方面有着独特的症疗经验和用药习惯，与传统中药相比，充分体现了同病异治的现象。因此应更加深入的挖掘此区的药物资源，丰富中华民族的医药资源库。